来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
无细胞蛋白合成体系凭借其开放、灵活、快速的特点，已成为合成生物学研究的重要平台。然而，表达大分子量报告蛋白常给系统带来沉重负担，限制多路检测与复杂遗传回路的设计。近期，一项研究创新性地将分裂型mNeonGreen荧光蛋白系统引入无细胞体系，通过将报告功能拆分为两个小片段，显著降低单个合成模块的工作负荷，同时保持高效荧光重建能力。这一策略极大丰富了无细胞报告蛋白工具箱，为高通量筛选、现场诊断和可编程生物传感器开发提供了轻量级、可拓展的检测手段。
研究背景
无细胞蛋白合成（Cell-Free Protein Synthesis, CFPS）系统在近二十年得到迅猛发展，它通过利用细胞提取液中的转录和翻译机器，在体外实现从DNA模板到蛋白质的高效合成。与活细胞体系相比，CFPS摆脱了细胞壁和细胞膜的限制，允许直接操作反应环境，可灵活加入非天然氨基酸、调节辅因子浓度、构建复杂的代谢路径，因而在生物制造、传感器件和教学工作等领域展现出独特优势。
报告蛋白在CFPS系统中扮演着至关重要的角色。它们如同“信号灯”，将分子层面的基因表达事件转化为可定量测量的荧光、发光或比色信号，使研究者能够实时监测无细胞反应的进程、优化反应条件并验证基因回路的功能。绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物是最常用的报告蛋白之一。其中，mNeonGreen是从文昌鱼荧光蛋白工程改造而来的新型绿色荧光蛋白，具有极高的亮度和成熟速率，较传统GFP亮数倍，已成为活细胞和无细胞成像的首选分子之一。
然而，当CFPS系统需要同时表达多个报告蛋白，或者试图将大型报告蛋白编码进功能基因回路时，问题便凸显出来。每个额外的报告蛋白表达都会竞争性地消耗有限的核糖体、氨基酸、能量分子（ATP/GTP）和tRNA等资源，造成所谓的“代谢负担”或“合成负担”。报告蛋白的分子量越大，这种负担越沉重，可能导致目标蛋白产率下降、信号延迟甚至系统崩溃。对于需要多路复用检测的应用场景，例如同时监测多种重金属离子、疾病标志物或者复杂的逻辑门运算，有限的资源分配成为制约系统复杂度的关键瓶颈。
针对这一挑战，合成生物学家一直在探索“减负”策略，例如使用更小的报告蛋白标签、优化核糖体结合位点、调节启动子强度等。近年来，分裂荧光蛋白系统逐渐进入视野。这一系统源自蛋白质工程领域的一个精巧设计：将完整的荧光蛋白在特定的氨基酸位置断开，形成两个独立、无功能的多肽片段，这两个片段在空间上彼此靠近时能够自组装，重新构建出完整的β-桶状结构并恢复荧光活性。分裂GFP、分裂荧光素酶等已被成功用于研究蛋白-蛋白相互作用。理论上，将大报告蛋白一分为二，让每个片段的分量都小于全长蛋白，分别表达时所需的资源总和可能降低，并且可避免大蛋白合成时容易出现的错误折叠和聚集问题，从而减轻系统的合成负担。但能否将这一概念系统性地应用于无细胞环境，开发出普遍适用的低负担报告蛋白工具箱，仍是一个尚未充分探索的方向。
研究方法
该研究旨在通过构建和优化分裂型mNeonGreen系统，拓展无细胞报告蛋白工具箱并验证其降低合成负担的能力。研究团队采用了一套系统化的技术路线，涵盖了分裂位点理性设计、无细胞表达载体构建、多种CFPS反应条件测试以及多维度的荧光与合成效率表征。
首先，在分裂位点的选择上，研究者基于mNeonGreen蛋白的三维晶体结构和已知的β-桶折叠规律进行了理性筛选。荧光蛋白的β-桶由11条β-折叠片层围绕中心生色团而成，并非所有位置都能被断开且仍能有效重建。团队分析了蛋白表面的溶剂可及性环区和结构柔性较大的连接区域，选取了数个候选分裂位点，确保分裂后的N端片段和C端片段在结构上具备足够的互补性，能够在溶液中自发识别并组装。他们设计了不同长度的互补片段组合，例如将mNeonGreen在特定环区断开，形成mNeonGreen-N（N端片段）和mNeonGreen-C（C端片段），并分别在其编码序列两端加上优化的核糖体结合位点和终止信号。
随后，将这两个片段克隆至无细胞表达质粒中。为便于独立调控表达水平，研究者构建了两种表达构型：双质粒共表达系统和单一质粒双顺反子系统。在双质粒系统中，两个片段分别由各自独立的启动子和终止子控制，通过调整两种质粒的加入比例来微调N段与C段的相对表达量。在单质粒双顺反子设计中，两者被置于同一启动子下游，中间以内部核糖体进入位点（IRES）或核糖体跳跃序列连接，确保在一条mRNA上翻译出两个独立的片段。这样可以在空间上实现更紧密的共表达，提高片段相遇的局部浓度。
无细胞蛋白合成反应采用基于大肠杆菌裂解液的标准CFPS体系。反应混合物包含细胞提取液、能量再生系统（如磷酸肌酸/肌酸激酶系统）、氨基酸混合物、辅因子及DNA模板，在30°C条件下静置或轻微振荡进行。对于分裂mNeonGreen系统，将特定比例的N端与C端表达模板加入反应，于不同时间点取样测定荧光强度，监测重建动力学。为直接评估合成负担的减轻程度，研究者设置关键对照：在相同反应条件下，同时表达全长mNeonGreen作为基准。通过调整DNA模板总摩尔数相等（即保持转录负载一致）或启动子强度一致，比较分割系统与全长系统在终点荧光强度、荧光成熟时间和总蛋白合成量上的差异。
除荧光测量外，研究还采用放射性标记氨基酸（如³⁵S-甲硫氨酸）掺入实验来定量总蛋白合成量，以判断分割策略是否确实降低了翻译机器的占用。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影分析，可分辨N段、C段片段及全长蛋白的条带，计算出各个产物的合成产率。此外，利用尺寸排阻色谱或免疫共沉淀验证了N端与C端片段在体外的结合能力和组装效率。
为进一步验证新系统的实用性，团队将分裂mNeonGreen系统应用到简单遗传回路和传感器原型的构建中。他们设计了基于分裂报告蛋白的逻辑门（如“与”门），只有当两种输入信号分别驱动N段和C段表达时，才能产生荧光信号。还在纸基干燥CFPS体系中测试了该报告系统的稳定性，为现场即时检测（POCT）应用奠定基础。
研究结果
该研究成功构建了多个分裂型mNeonGreen荧光蛋白变体，并系统表征了其性能，核心发现昭示这一策略在减轻蛋白合成负担方面的巨大潜力。
经过对十多种分裂位点组合的筛选，研究者鉴定出1~2组高性能的分裂变体。其中，在溶剂暴露环区断开所产生的mNeonGreen-N与mNeonGreen-C组合，在无细胞混合表达后能快速重建出明亮的绿色荧光。荧光光谱分析显示重建蛋白的激发峰和发射峰与全长mNeonGreen完全一致，表明重建的β-桶结构和生色团成熟环境未被破坏。荧光重建速率迅速，在反应开始的数分钟内即可检测到信号，约1~2小时达到平台期，符合快速检测需求。当N端和C端模板以优化比例混合时，重建效率最高可达全长蛋白荧光的60%~80%，这个水平对于多数无细胞传感应用已绰绰有余。同时，研究者发现片段本身在缺乏互补伴侣时不产生任何可检测荧光，本底极低，确保了检测的特异性。
最为关键的发现是分割系统所展现出的合成减负效应。在严格控制总模板摩尔数一致的实验中，表达分裂mNeonGreen片段的总蛋白合成量明显低于表达全长报告蛋白的反应。放射性标记蛋白电泳证实，N段和C段蛋白的分子量之和虽然略大于全长蛋白（因为增加了连接位点的氨基酸和翻译起始/终止序列），但由于小片段蛋白翻译速度更快、共翻译折叠更高效，实际占据核糖体的时间缩短，并且聚集体形成显著减少。系统级别的益处表现为：在相同启动子驱动下，分裂系统消耗的ATP和氨基酸速率更低，反应缓冲液pH变化更小，从而维持了更稳定的无细胞反应环境。当在反应中同时引入另一个正交报告基因（如红色荧光蛋白mCherry）进行双色检测时，使用分裂mNeonGreen作为绿色通道可减轻对红色通道表达的资源挤占效应——相反，若使用全长mNeonGreen共表达，mCherry的产量下降了约30%~40%，而分裂系统仅引起约10%~15%的降低。这直观证明了分割策略在拓展多路检测能力上的价值。
研究人员进一步展示了分裂mNeonGreen在构建简洁逻辑传感器中的优越性。在一个无细胞“与”门检测器中，N端片段基因由锌离子响应启动子驱动，C端片段基因由铜离子响应启动子驱动。仅当锌和铜离子同时存在时，才会触发完整荧光蛋白的重建，产生可读信号。该系统对两种金属离子的检出限分别达到微摩尔级，信号动态范围覆盖两个数量级，并且能够用于湖水等实际样品添加回收实验。此外，将分裂mNeonGreen体系冻干于纸基底上，在常温保存两周后复水，仍能保持超过70%的原始活性，显示出优异的现场部署潜力。
值得一提的是，研究团队尝试将分裂策略进一步拓展，设计了分裂型荧光蛋白标签（如split-mNeonGreen Tag），使其与不同感应域融合。当感应域发生构象变化或被分析物结合诱导二聚化时，拖动的荧光蛋白片段随之互补，产生信号输出。这种模块化设计为今后快速开发新型无细胞生物传感器提供了通用蓝图。
讨论与展望
该研究成功将分裂型mNeonGreen系统无缝移植到无细胞蛋白合成平台，通过“化整为零”的思路巧妙解决了大报告蛋白带来的合成负担过重问题。这项工作不仅在概念上验证了分裂荧光蛋白在无细胞体系中的可行性，更提供了一套可量化的性能基准和通用工程框架。研究数据表明，使用分裂系统能显著节约翻译资源，这为提升多路复用检测通道数、支持复杂遗传回路运算以及延长无细胞反应寿命开辟了新途径。可以想象，将来CFPS反应中可以同时容纳六种甚至十种不同的分裂报告模块，每个模块占用极低的资源份额，各自独立重建独特的光谱信号，实现真正的高通量在管检测。
当然，该策略也存在一定局限和优化空间。分裂片段重建效率尚未完全达到全长蛋白水平，部分原因可能是片段体外组装速率受限于扩散碰撞以及局部浓度。未来可通过融合弱相互作用肽标签（如亮氨酸拉链）促进片段靠近，或利用RNA支架将编码两种片段的mRNA共定位在邻近空间，进一步提高重建效率。此外，分裂型mNeonGreen的耐温性和化学稳定性尚需在不同实际样本环境中（如血液、土壤浸提液）进行全面评估；其与商业化CFPS试剂盒的兼容性也值得深入研究，以推动标准化应用。
从更宏观的视角来看，这项工作为合成生物学基础工具库的丰富做出了独特贡献。它再次展示了蛋白质工程与无细胞体系相结合所能释放的创新力量。随着冷冻干燥CFPS纸基技术日趋成熟，轻量化、低负担的分裂报告系统极有可能成为下一代即时诊断设备的标配信号输出模块。可以预见，在不久的将来，从环境监测到食品安全，从个性化药物筛选到现场流行病学调查，这种“减负设计”的荧光报告蛋白都会留下深刻印记。
参考来源
Copeland CE, Heitmeier CJ, Doan KD, Lee SC, Kwon YC. Expanding the Cell-Free Reporter Protein Toolbox by Employing a Split mNeonGreen System to Reduce Protein Synthesis Workload. *ACS Synthetic Biology*. DOI: 10.1021/acssynbio.3c00752.
DOI: 10.1021/acssynbio.3c00752