来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
菱角（*Trapa bispinosa*）壳作为典型的农业加工副产物，年废弃量巨大，但其富含的多酚与多糖类物质具有潜在的抗氧化、降糖功效。如何高效释放并增强这些活性成分的功能，是资源化利用的关键。本期解读的研究中，Sun等利用药用真菌紫芝（*Ganoderma sinense*）对菱角壳进行液体-固体双相发酵，系统表征了发酵产物中多糖与醇提物的化学结构，并全面评价其抗氧化、降糖酶抑制及抑菌活性，为农废物的真菌转化与高值化开发提供了全新策略。
研究背景
菱角壳是菱角加工过程中的主要副产物，约占鲜果重的30%–40%，通常被丢弃或焚烧，既浪费资源又造成环境负担。近年来的研究表明，菱角壳提取物含有丰富的酚酸类（如没食子酸、鞣花酸）、黄酮类以及多糖成分，展现出抗氧化、抗炎、降血糖等生物学活性。然而，天然状态下活性成分的存在形式往往与细胞壁基质紧密结合，提取效率受限，且部分大分子多糖的生物利用率不高，“原生形态”的粗提物活性表现常常平平。
药用真菌双向发酵技术是将真菌液体培养获取大量菌丝体后，再将其接入固体基质进行固态转化，这一过程融合了真菌强大的胞外酶系对底物大分子的降解与二次代谢产物的生成能力。紫芝作为我国传统珍稀药用菌，本身就能合成高活性的灵芝多糖与三萜，其胞外酶（纤维素酶、漆酶、糖苷水解酶等）可能特异性地断裂菱角壳纤维质结构中的化学键，释放被束缚的酚类物质，同时部分降解壳多糖，生成分子量较低、溶解性更佳且具有更强生物活性的多糖片段。
基于此，Sun等抛弃传统的直接溶剂提取模式，另辟蹊径，利用紫芝的双相发酵系统对菱角壳进行“生物加工”，旨在同步完成底物的结构解构与功能成分的提质增效。研究者将目光锁定在两类核心活性产物——多糖（水提醇沉产物）与醇提物（醇溶小分子群），通过对比发酵前后两类产物的得率、理化性质、化学组成及体外活性的变化，揭示了真菌发酵“重塑”农废生物活性的潜力，为该技术的产业化应用奠定了科学基础。
研究方法
该研究的整体实验路线围绕“菌种活化—双相发酵—产物提取与纯化—结构分析—活性评价”展开，逻辑清晰且层次分明。
**菌种的活化与种子液制备**：以保存的紫芝菌种经PDA斜面活化后，转接液体种子培养基（碳源以葡萄糖为主），在28 ℃、150 rpm条件下振荡培养5–7天，获得生长旺盛、呈均匀球粒状的液体菌种。
**双相发酵体系构建**：将干燥并粉碎至一定粒度的菱角壳粉末作为发酵基质的核心。第一阶段为液体深层发酵，将液体菌种按一定接种量接入以菱角壳粉为主要碳源并辅以少量氮源及无机盐的液体培养基中，使紫芝菌丝在均相环境中快速增殖并分泌大量胞外酶。第二阶段，当液体发酵到达菌丝体生物量顶峰时，整体转入固态发酵模式——将发酵醪作为接种物与适量补充的菱角壳固体基质拌匀，保持恒定的水分活度和温度，继续静态发酵一定周期。此过程利用了液体阶段产生的高浓度酶液与菌丝体共同对固体壳粉进行浸解与转化。同时设置未发酵的菱角壳直接提取作为对照组。
**多糖与醇提物的分级制备**：发酵完成后，将产物经冷冻干燥，依次进行“水提—醇沉—醇提”的两步分离策略。粗多糖的获取采用热水浸提（90 ℃，2小时×3次），合并提取液浓缩后，加入4倍体积无水乙醇过夜沉淀，离心收集沉淀物，经Sevag法脱蛋白、透析脱盐、真空冷冻干燥，即得发酵菱角壳粗多糖。上清乙醇溶液经减压浓缩去除溶剂，得到醇提物浸膏。后续对粗多糖进行DEAE阴离子交换层析和琼脂糖凝胶过滤层析进一步纯化，以获得均一多糖组分，用于精细结构解析。
**化学结构与理化性质表征**：采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，高效体积排阻色谱（HPSEC）分析分子量分布；三氟乙酸完全水解后，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化反相高效液相色谱法识别单糖组成与摩尔比；傅里叶变换红外光谱（FT-IR）扫描特征官能团；扫描电镜（SEM）观察多糖微观形貌。醇提物则利用福林-酚试剂法检测总酚含量，并通过超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）进行主要酚类成分的定性鉴定。
**生物活性多维评价**：抗氧化活性方面，严格测定DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力，并以维生素C为阳性对照，结果以半抑制浓度（IC₅₀）表示。降糖潜力通过α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制实验来评估，以阿卡波糖为阳性药物。抑菌作用采取琼脂孔扩散法，对革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和阴性菌（如大肠杆菌）的最小抑菌浓度（MIC）进行了测定，并记录抑菌圈直径。
研究结果
紫芝双相发酵显著改变了菱角壳基质中多糖与醇提物的得率与活性面貌。研究核心数据围绕发酵前后对比进行。
**多糖得率与结构的变化**：发酵后粗多糖得率由对照的2.8%提升至4.5%，相对增加了约60%。经过纯化，从发酵产物中分离得到两个主要多糖组分GSPS-1和GSPS-2，分子量分别约为3.2×10⁴ Da和6.8×10³ Da，相较未发酵菱角壳多糖（主要以＞10⁵ Da的大分子为主），发酵后多糖分子量显著降低且分布更趋均一。单糖组成解析显示，发酵多糖含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖及少量木糖和岩藻糖，其中半乳糖和甘露糖的摩尔比明显上升，暗示紫芝分泌的甘露聚糖和半乳甘露聚糖酶解产物被整合入所获多糖组分。FT-IR图谱呈现典型多糖特征吸收峰（3400 cm⁻¹附近的O–H伸缩振动、2920 cm⁻¹的C–H伸缩振动、1650 cm⁻¹的酰胺带以及1000–1200 cm⁻¹的吡喃糖骨架振动），并提示存在乙酰基和少量的糖醛酸修饰。SEM图则显示，发酵多糖的微观表面由原先的致密片层状转变为多孔网络状，比表面积大幅提高，这为其更好的水溶性和反应潜在位点暴露提供了形态学解释。
**醇提物总酚含量与成分鉴定**：发酵醇提物的总酚含量高达287.3 mg没食子酸当量/g提取物，是未发酵壳醇提物的1.8倍。高分辨质谱鉴定出至少12种主要酚类化合物，以没食子酸、没食子酸甲酯、鞣花酸和柯里拉京等鞣质类为主，发酵后新生成了紫芝特征性酚酸——原儿茶酸和少量苯乳酸。这一现象证实了真菌代谢不仅能溶释壳粉结合的酚酸，还能通过苯丙烷类代谢途径合成新的酚酸，使醇提物的化学多样性得到扩展。
**抗氧化活性**：在自由基清除模型中，发酵多糖GSPS-2对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除IC₅₀分别达到0.42 mg/mL和0.31 mg/mL，虽逊于维生素C，但显著优于未发酵多糖（IC₅₀ > 1.0 mg/mL）。醇提物的抗氧化能力更为突出，发酵醇提物的DPPH清除IC₅₀仅为12.5 μg/mL，与阳性对照Vc（8.2 μg/mL）处于同一数量级，铁还原力测定也呈现相似的剂量依赖关系，表明其是主要抗氧化贡献相。
**降糖酶抑制与抑菌活性**：α-葡萄糖苷酶抑制实验中，发酵多糖GSPS-2在1.0 mg/mL浓度下抑制率达68.4%，约为未发酵多糖的3倍；发酵醇提物在200 μg/mL时抑制率高达85.1%，与阿卡波糖相当。α-淀粉酶抑制趋势虽弱于葡萄糖苷酶，但同样表现出发酵产物活性占优的格局。抑菌实验显示，发酵醇提物对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用，MIC为0.5 mg/mL，而对大肠杆菌活性较弱；发酵多糖的抑菌活性相对温和，但亦能观察到对革兰氏阳性菌的轻微抑制作用，这或与多糖本身的屏障干扰及微量结合酚有关。
讨论与展望
该研究巧妙地将紫芝这一药用真菌的代谢能力与菱角壳废弃物的结构特性结合起来，通过双相发酵实现了“一举两得”：一方面，紫芝的木质纤维素降解酶系高效破坏了菱角壳致密的细胞壁，将被包埋的酚类物质大量释放，并部分解聚和修饰多糖大分子，提高了活性成分的溶出度和生物可及性；另一方面，紫芝在生长过程中自身合成的灵芝多糖、酚酸等活性物质与壳源组分协同耦合，赋予了最终提取物更优异的抗氧化与降糖酶抑制性能。尤其是发酵醇提物中总酚的剧增与新酚酸的鉴定，提示酚类物质的酶解释放与真菌次生代谢的叠加效应是发酵增活的关键机理。
从应用层面来看，该技术路线为菱角壳等富含酚-多糖复合物的农林废弃物提供了绿色、温和且附加值高的转化范式。未来研究可向以下方向推进：一是对双相发酵的工艺参数（接种量、固液比、时间、温湿度）进行响应面优化，进一步最大化目标活性组分收率；二是利用现代分离与质谱网络解析手段，定向鉴定具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的单体成分，深入构效关系；三是通过细胞和动物模型验证发酵产物的降血糖、抗炎功效及安全性，推动功能食品或饲料添加剂的开发。更值得期待的是，将这一真菌发酵平台拓展至其他富含多酚的废弃物（如核桃青皮、石榴皮等），探索其作为通用性生物精炼技术的普适性。
参考来源
Sun X, Lei Q, Chen Q, et al. Biphasic Fermentation of *Trapa bispinosa* Shells by *Ganoderma sinense* and Characterization of Its Polysaccharides and Alcoholic Extract and Analysis of Their Bioactivity. *Molecules*, 2024, 29(6): 1238. DOI: 10.3390/molecules29061238
DOI: 10.3390/molecules29061238