来源：Volatile evolutions during solid-state fermentation of oats by mono- and co-cultures: A Flavoromic approach using classical chemometric and machine learning techniques（Food Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
固态发酵（SSF）能够增强燕麦的生物活性潜力，但混合微生物体系中挥发性化合物形成的时间动态特征仍鲜有表征。本研究以少孢根霉单菌培养及少孢根霉与植物乳杆菌共培养体系对燕麦进行120小时固态发酵，鉴定出跨越10个化学类别的55种挥发性化合物。研究发现共培养体系在醇类、羧酸、酯类和酮类物质上产量更高，且有效抑制了发酵中期支链醛的积累。非线性随机森林回归模型比线性偏最小二乘回归更能捕捉挥发性物质的动态轨迹，为发酵燕麦产品的开发提供了系统层面的风味指纹。
研究背景
固态发酵是一种古老的生物加工技术，近年因能耗和水耗低、避免使用环境有害溶剂、以及具备高价值生物转化潜力而重新获得关注。相较于液态发酵，固态发酵需水量更少，通常更适宜好氧真菌微生物的生长，由此产生不同的发酵结果。发酵利用所选微生物的内在代谢能力对天然底物进行改造，有潜力开发具有更好货架稳定性的新型营养、生物活性和功能特性。
谷物和豆类因富含碳水化合物，常被用于固态发酵以增强其生物活性。燕麦在所有谷物中拥有最高的不饱和脂质含量、高蛋白质含量，并富含β-葡聚糖等纤维。燕麦风味中性、带有坚果至微甜的味道，可同时用于咸甜菜肴，因此被广泛接受为食品主食。该谷物还含有高水平、紧密结合的生物活性化合物，包括燕麦生物碱、酚类化合物等。
尽管固态发酵可增强燕麦的生物活性潜力，但挥发性化合物形成的时间动态——特别是在混合微生物体系中——仍缺乏系统表征。这些挥发性物质不仅贡献感官属性，也反映发酵过程中潜在的代谢相互作用。
研究方法
2.1 固态发酵
#### 2.1.1 研究材料
脱壳、蒸汽处理的燕麦米（Avena sativa）（Harraway and Son Ltd.，达尼丁，新西兰）获得后经检查，于4°C储存备用。少孢根霉（Rhizopus microsporus var. oligosporus (Saito) Shipper et Stalpers，ATCC 22959）以冻干粉末形式购自In Vitro Technologies（奥克兰，新西兰），冷藏于4°C；植物乳杆菌299v（Lp. plantarum 299v）从商业来源分离，以甘油菌形式于−80°C保存（Jarrow Formulas， Inc.， 2025）。
#### 2.1.2 接种物制备
冻干少孢根霉孢子经活化后，保存于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（Fort Richards Laboratories，奥克兰，新西兰）斜面培养基中，置于4°C。从斜面取米粒大小的琼脂块接种至PDA平板，于30°C培养5天。通过轻轻刮取细胞和菌丝体至新鲜收集容器中收获细胞，随后用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗PDA平板两次。最终体积补足至10 mL并涡旋混合。将水相部分移取至第二个收集容器中以留下菌丝体，此即为少孢根霉接种物。植物乳杆菌细胞在De Man， Rogosa and Sharpe（MRS）肉汤（Fort Richards Laboratories，奥克兰，新西兰）中于37°C厌氧传代培养两次，每次过夜。植物乳杆菌细胞通过离心（3000 ×g，10 min；5810R，Eppendorf，汉堡，德国）收获，随后进行两次PBS洗涤步骤。细菌细胞重悬于PBS中，用作固态发酵接种物。
#### 2.1.3 发酵
燕麦经冲洗后在蒸馏水中于25°C浸泡12小时，然后沥干并于121°C高压灭菌15分钟。冷却后，无菌操作将灭菌燕麦转移至搅拌机中，每批研磨30秒至一致的研磨粒度，以提高微生物可及性。该条件下的研磨粒度可重复性通过使用激光衍射粒度分析的独立预实验验证，结果显示重复研磨批次间变异极小。取两份研磨燕麦等分试样转移至无菌3 L玻璃烧杯中，准备接种。接种物首先引入无菌水中确保均匀分散，然后将全部水量以50：60的底物与接种水质量比与燕麦底物混合。单菌培养体系仅接种少孢根霉，目标为每克1 × 10⁶菌落形成单位（CFU）；共培养体系同时接种少孢根霉和植物乳杆菌，各为每克1 × 10⁶ CFU。将70 ± 5 g接种燕麦等分称量至无菌培养皿（90 mm × 20 mm，直径 × 高度）中，两个体系共生成24个样品，包括8个时间点的3个重复。单菌培养接种燕麦在30°C有氧条件下培养至多120小时，共培养接种燕麦在34°C有氧条件下培养至多120小时。单菌培养的30°C incubation温度基于先前研究报告的少孢根霉最适生长和酶活性以及菌丝发育的定性观察选定（Nahas， 1988）。共培养的34°C incubation温度被选为生物学相关的折中方案，以同时支持少孢根霉和植物乳杆菌——后者的最适代谢活性据报道约为35–37°C，并已成功应用于燕麦固态发酵（Green et al.， 2025）。虽然培养温度可能影响微生物代谢，但本研究旨在比较单菌培养和共培养发酵在生物学相关条件下产生的系统水平挥发性结果。因此，温度效应被承认为直接比较发酵系统之间的一个局限，结论在微生物组成和培养条件的联合生物学效应背景下提出。
#### 2.1.4 时间点采样
基于捕捉固态发酵过程中挥发性变化的预实验工作，在0、2、5、12、24、48、72和120小时后，每个时间点从培养箱中取出三个培养皿并置于冰上以抑制进一步发酵。冷却后，每个发酵样品取两份5 g ± 0.1 g等分试样置于20 mL气相色谱样品瓶中，于−60°C储存用于挥发性分析。
【数据】菌株：少孢根霉ATCC 22959、植物乳杆菌299v；接种量：1 × 10⁶ CFU/g；浸泡：25°C、12h；灭菌：121°C、15min；研磨：30s/批；底物与接种水质量比：50：60；样品量：70 ± 5 g/皿；培养温度：单菌30°C、共培养34°C；培养时间：至多120h；取样时间点：0、2、5、12、24、48、72、120h；样品储存：−60°C
2.2 发酵燕麦样品的挥发性分析
使用HS-SPME-GC–MS进行挥发性指纹分析的程序参照我们先前研究的方法并做小幅调整（Green et al.， 2025）。选择HS-SPME作为无溶剂、非破坏性技术，可保留天然香气特征并为非靶向GC–MS分析提供跨挥发性类别的广泛覆盖。虽然HS-SPME可能对低挥发性化合物的代表性不足，但该方法适用于捕捉固态发酵过程中由发酵驱动的优势挥发性变化，符合本研究的目标。使用配备自动进样器（Agilent PAL RSI 85；Palo Alto， CA， USA）的Agilent Technologies 6890 N气相色谱仪（Agilent Technologies， Santa Clara， CA， USA）进行分析。
#### 2.2.1 顶空固相微萃取
样品在HS-SPME分析前于自动进样器冷却托盘中的4°C条件下解冻并保持，样品在该条件下的稳定性经预实验验证，显示在长达18小时的保持时间内挥发性谱图变化极小。每天开始和结束时运行空白样品以监测残留，样品随机化以尽量减少顺序效应。样品瓶在40°C下孵育5分钟并搅拌以达到平衡状态。将二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷混合极性SPME纤维（50/30 μm）（Supelco Inc.， Bellefonte， PA， USA）暴露于样品瓶顶空，在40°C下萃取30分钟。萃取温度和持续时间基于预方法优化选定，以在分析可重复性与分析物回收效率之间取得平衡。选择混合极性SPME纤维以允许对广泛的挥发性化学类别进行采样，支持非靶向GC–MS分析，并可与现有食品挥发性组学文献直接比较（Green et al.， 2025）。
#### 2.2.2 气相色谱-质谱联用
分析物以不分流模式解吸2分钟，氦气作为载气，恒定流速1 mL/min。使用极性Zebron ZB-WAX（Phenomenex， Torrance， CA， USA）色谱柱，59 m，内径0.32 mm，膜厚0.50 μm进行分析物分离。吹扫流速设为50 mL/min持续6分钟，随后流速为20 mL/min。GC烘箱程序起始于50°C保持5分钟，然后以5°C/min的速率升至210°C。温度随后以10°C/min的速率再次升至240°C，最终保持20分钟。质谱使用配备三轴检测器的5975B VL质谱选择性检测器（Agilent Technologies， Santa Clara， CA， USA）在电子电离模式下测量，能量70 eV，范围29–300 m/z。使用相同方法注入烷烃标准品（C7-C30）以计算线性保留指数（RI）。挥发性物质通过将解卷积峰RI和质谱与国家标准与技术研究院2014（NIST14）谱库比对进行初步鉴定。
【数据】SPME纤维：DVB/CAR/PDMS，50/30 μm；孵育：40°C、5min；萃取：40°C、30min；解吸：不分流、2min；载气：氦气、1 mL/min；色谱柱：Zebron ZB-WAX，59m × 0.32mm × 0.50μm；程序：50°C保持5min→5°C/min至210°C→10°C/min至240°C保持20min；电离：70eV；扫描范围：29–300 m/z；标准品：C7-C30烷烃
2.3 数据分析
#### 2.3.1 挥发性数据预处理
使用PARADISe（基于PARAFAC2的解卷积和鉴定系统）3.2版（Johnsen et al.， 2017）对HS-SPME-GC–MS数据进行峰解卷积和鉴定（Warburton et al.， 2022）。重复色谱图叠加并与空白样品交叉检查，手动选择相关峰区间。对每个选定区间计算模型，最多10个组分。
【数据】软件：PARADISe 3.2；模型组分：最多10个
研究结果
3.1 随发酵时间和体系的演化
#### 3.1.1 HS-SPME-GC–MS数据初步分析与峰鉴定
首先通过叠加所有重复色谱图评估挥发性物质检测和HS-SPME-GC–MS方法的可重复性。样品重复间变异很小，洗脱谱图相似且基线持续较低。其次，对单菌和共培养体系的特定生物学重复突出显示了固态发酵0、48和120小时随时间的总体趋势（附录A）。这揭示了两个体系中从固态发酵开始到结束挥发性谱图的明显变化。
#### 3.1.2 共培养与单菌体系的关键挥发性化学类别差异
初步分析后，将解卷积和鉴定的峰按化学分类分组，并绘制为单菌和共培养体系的比例（图1）。总体而言，两个体系共检测到55种化合物（附录B）。其中包括2种缩醛、8种醇、4种醛、5种芳香族化合物、7种羧酸、14种酯、3种呋喃、8种酮、3种酚和1种萜类。相比之下，Sun等人（2023）在使用酿酒酵母和植物乳杆菌2329共接种的固态发酵处理燕麦中鉴定出60种化合物，而Castaneda等人（2025）在植物乳杆菌液态发酵和少孢根霉固态发酵序批处理燕麦天培中鉴定出65种挥发性化合物。总体而言，本研究中检测到的挥发性物质数量和范围与先前工作一致。
图1中可以看到固态发酵时间内单菌或共培养体系挥发性峰面积的明显变化。重要的是，两个体系在固态发酵0小时时表现出相似的化学类别比例，表明0小时时间点采样确实得到了充分控制。具体而言，在34°C共培养中添加植物乳杆菌对总挥发性贡献的总体影响有限，这由时间0时的相似比例所显示。对于两个体系，醛类在0小时时占挥发性化合物的最大比例，其次是酯类和呋喃（图1，A和B）。醇类和酮类各占峰面积比例的约10%，而芳香族化合物、缩醛、羧酸、酚类和萜类各占总峰面积的不到1%（图1，A和B）。
【数据】检测化合物总数：55种（2缩醛、8醇、4醛、5芳香族、7羧酸、14酯、3呋喃、8酮、3酚、1萜类）；0h醛类占比：最大；0h醇类/酮类占比：各约10%；0h芳香族/缩醛/羧酸/酚类/萜类占比：各<1%；对比文献鉴定数：60种（Sun et al.， 2023）、65种（Castaneda et al.， 2025）
#### 3.1.2.1 醛类
具体来看醛类，图1C和D显示此类化合物在固态发酵0至5小时内快速下降。在包含植物乳杆菌的34°C共接种体系中，下降更快、幅度更大。醛类的初始存在是预期的，因为燕麦中高含量的不饱和脂肪（如亚油酸和油酸）被内在燕麦脂肪酶催化氧化生成醛类（McGorrin， 2019）。在高水平下，这些化合物会给燕麦产品带来青草味、生腥味等不良风味，因此降低这些化合物的水平有利于理想的感官属性（Sun et al.， 2023）。先前研究表明少孢根霉在超过25°C的温度下表现出降低的还原酶活性（Nahas， 1988）。因此，共培养体系中使用的高温（34°C）不太可能加速真菌驱动的转化，而更可能与植物乳杆菌相关的代谢和酶贡献一致。已知植物乳杆菌含有醛脱氢酶，由于这些化合物碳原子上略带正电荷使其对亲核试剂极具吸引力，醛脱氢酶可以容易地催化醛的还原（Smit et al.， 2009）。这一效应在先前研究中观察到，植物乳杆菌单独在固态发酵5小时后使总挥发性醛实现了8倍减少（Green et al.， 2025）。综合来看，这些发现表明共接种体系中更广泛的微生物酶活性范围加速了发酵早期的醛还原。
图2呈现了所选化合物各体系随时间的平均挥发性峰面积变化。以特定醛为例，戊醛和己醛很好地例证了这一趋势，在固态发酵开始时水平最高，5小时内迅速下降至最低水平（图2）。值得注意的是，共培养体系显著加快了戊醛和己醛的下降速率并维持更低的峰面积，表现为在固态发酵2至72小时和2至48小时期间分别显著（p < 0.05）低于相应单菌培养体系的峰面积（图2）。这再次表明植物乳杆菌表达的其他酶（如醛脱氢酶）的存在，在共培养中比单菌培养发酵燕麦加速了醛的还原，因为少孢根霉在共培养使用的较高培养温度下表现出降低的酶活性（Nahas， 1988）。Sun等人（2023）和Castaneda等人（2025）也报道了酿酒酵母和植物乳杆菌固态发酵后醛类减少高达72%，而植物乳杆菌液态发酵后少孢根霉固态发酵的序批处理显示燕麦类底物的醛类总体减少。
与维持低醛水平的共培养体系不同，少孢根霉单菌培养体系在24小时时间点出现醛类峰值，增加至初始水平的两倍，然后在固态发酵72小时前再次下降至可忽略的峰面积（图1，C和D）。这是由于支链醛的上升，由图2中同一体系2至72小时间的2-甲基丁醛峰所例证。由于体系间培养温度不同，温度依赖性反应动力学和微生物活性也可能有所贡献。然而，在较温暖的共培养条件下醛类中期峰值的完全抑制与植物乳杆菌存在时微生物转化增加一致。乳酸菌减轻醛类二次峰的一个可能解释是植物乳杆菌在醛代谢上竞争过少孢根霉。具体而言，少孢根霉可以通过蛋白水解从较长肽链上切割氨基酸，增加美拉德反应前体（还原糖和氨基酸）的量，从而通过非酶美拉德反应间接增加2-甲基丁醛等支链斯特雷克醛（Zhu et al.， 2023）。此外，少孢根霉可以通过α-酮异己酸中间体直接分解代谢燕麦氨基酸（如亮氨酸）生成甲基化醛，解释了固态发酵中后期此类化合物的峰值（Feng et al.， 2007； Meng et al.， 2021）。向体系中添加植物乳杆菌可能使这些细胞利用生成的氨基酸进行自身细胞生长，将这些前体从美拉德反应途径中分流。这可以解释固态发酵中时间点醛类峰值的减轻。对这种非线性挥发性趋势的考虑表明非线性数据建模有潜力正确捕捉和表征随时间的动态变化。由于没有其他论文对挥发性演化进行时间采样，这一发现是新颖的，未来利用乳酸菌和丝状真菌的共培养系统在考虑固态发酵时长以实现特定挥发性目标时应予以批判性考虑（Castaneda et al.， 2025； He et al.， 2022； Sun et al.， 2023； Wronkowska et al.， 2022）。这也可以解释文献中应用少孢根霉不同发酵时长所观察到的差异，因为总体差异可能只是捕捉了美拉德反应产物及这些产物下游利用的不同程度（Castaneda et al.， 2025； He et al.， 2022； Sun et al.， 2023； Wronkowska et al.， 2022）。支链醛峰值的减轻...
【数据】醛类下降时间：0–5h；戊醛显著差异窗口：2–72h；己醛显著差异窗口：2–48h；显著性水平：p < 0.05；文献醛类降幅：高达72%；单菌24h醛峰：初始水平2倍；单菌醛恢复至可忽略时间：72h；2-甲基丁醛升高窗口：2–72h；文献单菌醛降幅：8倍（5h）
3.2 化学计量学与机器学习建模
【数据】模型：PLS-R与RF-R；特征选择阈值：VIP > 1（PLS-R）、Gini-importance > 500（RF-R）；置信区间：95%
讨论与解读
本研究考察了少孢根霉单菌培养及少孢根霉与植物乳杆菌共培养在120小时固态发酵过程中燕麦挥发性物质的不同演化。总体上，大多数化学类别（如醇类、羧酸类、酯类和酮类）在共培养体系中产生更快且丰度更高。这归因于特定发酵条件下两种微生物的协同代谢。植物乳杆菌的添加还减轻了固态发酵中后期甲基醛的积累，因其利用了少孢根霉释放的氨基酸和糖——这些物质原本可作为美拉德反应前体。酚类在共培养体系中也更为丰富，总体上共培养体系的类别化合物总峰面积大于单菌培养体系，可能意味着更复杂的风味特征。
虽然本研究基于时间分辨的挥发性组学指纹提供了固态发酵过程中挥发性演化的系统级见解，但与感官知觉的直接关联超出本研究范围，值得在未来整合感官分析与靶向挥发性组学的研究中加以探讨。整个固态发酵过程中的采样凸显了某些挥发性物质在0小时和120小时以外的时间点达到峰值，这突显了通过在峰值时终止固态发酵来优化特定挥发性物质生产的可能性。
编译者解读
本研究以时间序列采样结合非线性机器学习建模，揭示了共培养体系中微生物互作对风味形成的独特贡献——特别是植物乳杆菌对支链醛峰值的抑制机制，为设计定向风味的发酵工艺提供了全新抓手。方法上，RF-R与PLS-R的对比建模思路值得借鉴，但温度差异（30°C vs 34°C）作为混杂因素未完全消解，后续研究可考虑统一温度或增设交叉实验。从应用角度，利用共培养体系在更短时间内降低不良醛类并富集酯类、醇类，对燕麦产品风味品质提升具有直接转化价值。
参考来源
Green S. Volatile evolutions during solid-state fermentation of oats by mono- and co-cultures: A Flavoromic approach using classical chemometric and machine learning techniques. Food Chemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.147863
DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.147863