来源：Microb Cell Fact | 编译：DNA Lab Space
导读
丙烯酸（AA）是年市场规模超180亿美元的重要工业化学品，目前几乎完全依赖石油生产。本研究以酿酒酵母为宿主，通过适应性实验室进化（ALE）解析了AA耐受性的遗传基础——线粒体基因ACH1和ETR1是关键靶点，并筛选了三条生物合成途径，最终通过β-丙氨酸途径实现30 mg/L的AA直接发酵生产。该工作为可再生丙烯酸的微生物合成奠定了平台基础。
研究背景
丙烯酸是一种高价值平台化学品，广泛应用于洗涤剂、吸收材料、纺织、着色剂等领域，预计2033年市场规模至少达180亿美元。当前丙烯酸的生产几乎完全依赖石油路线，伴随大量温室气体排放及有毒副产物（如丙烯醛）。在化工行业减排承诺的推动下，可再生生物基丙烯酸生产工艺受到关注。已有研究多经由3-羟基丙酸（3HP）中间体再经化学脱水获得丙烯酸，但额外化学催化和纯化步骤抬高了成本，经济性尚未得到验证。因此，开发直接发酵生产丙烯酸的路线成为研究热点。为实现经济竞争力，既需要廉价的原料（如木质纤维素生物质水解液），也需要高效的分离策略——低pH发酵有利于有机酸的纯化。酿酒酵母因其耐低pH、遗传操作成熟的优势，成为值得探索的宿主。
研究方法
质粒与菌株
本研究所用质粒见补充表2。质粒繁殖与克隆使用大肠杆菌DH5α菌株。所用酿酒酵母菌株概览见补充表3。所有导入酵母的外源基因均由Twist Bioscience或IDT合成，并经密码子优化以在酿酒酵母中高效表达（补充表4）。除非另有说明，菌株均在CRISPR-ready酿酒酵母菌株IMX581[54]基础上构建。
培养基
大肠杆菌在添加相应抗生素的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上筛选培养（100 mg/L氨苄青霉素、50 mg/L卡那霉素、30 mg/L氯霉素）。液体培养使用含相同浓度抗生素的LB培养基。酵母细胞在YPD培养基中培养，含10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖。含有URA3质粒的菌株使用无尿嘧啶的合成完全培养基（SD-Ura）筛选，成分包括6.9 g/L无氨基酸酵母氮源碱（YNB）、0.77 g/L无尿嘧啶完全补充混合物（CSM-ura）、20 g/L葡萄糖和20 g/L琼脂粉。URA3标记的反向筛选使用SD+5'-FOA平板，含6.7 g/L YNB、0.78 g/L CSM和1 g/L 5-氟乳清酸（5-FOA）。含有kanMX抗性基因的酵母菌株在添加200 mg/L G418的YPD平板上筛选。大部分培养在Delft摇瓶培养基中进行，成分含（每升）7.5 g (NH4)2SO4、14.4 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O、2 mL微量元素溶液和1 mL维生素溶液，pH用KOH调至6.5（除非另有说明）。葡萄糖（20 g/L）作为碳源（除非另有说明）。β-丙氨酸、3HP或AA根据具体实验需要添加到培养基中。β-丙氨酸用于β-丙氨酸途径的筛选，3HP在一次筛选实验中添加，AA用于进化实验或降解实验。维生素和微量元素溶液按此前描述的方法制备[55]。进化实验和进化克隆测试使用Verduyn培养基[55]，以97 mL/L 0.5 M柠檬酸和103 mL/L Na2HPO4或K2HPO4缓冲至pH 5，此体系此前用于有机酸耐受性进化[29, 40]。适用时向培养基补充60 mg/L尿嘧啶。厌氧培养时，分别添加10 mg/L麦角固醇和420 mg/L Tween80。
质粒与菌株构建
质粒构建使用MoClo工具包及其扩展模块[56, 57]。对于要转化到酿酒酵母中的质粒，首先构建了MoClo level 2质粒pLE_YTK007，含URA3酵母筛选标记、2µ复制起点、细菌卡那霉素抗性和细菌GFP dropout筛选元件。相应途径基因按顺序插入GFP dropout位点。引导RNA（gRNA）序列使用benchling CRISPR工具鉴定。质粒正确性通过Sanger测序或Eurofins Genomics的全质粒测序确认。基因整合、删除和突变采用CRISPR/Cas9技术，方法与此前描述类似[54]。质粒和片段的酵母转化采用改良的醋酸锂法[58]，热激前加入10%（v/v）DMSO，随后在SD-ura平板上筛选。基因组修饰通过诊断性PCR确认。删除通过扩增子大小的预期变化确认，点突变通过扩增靶位点周围约500 bp片段并进行Sanger测序验证。
生长筛选
生长测试在Growth profiler 960（Enzyscreen）上进行，使用96孔半深孔板，培养体积250 µL。单菌落接种到5 mL相应培养基中，30 °C、200 rpm振荡培养过夜。预培养物以起始OD600为0.1接种到孔板中，30 °C、250 rpm振荡培养。菌株最大比生长速率通过ln(OD)对时间作图，在至少2.5 h的时间窗口内取最大斜率计算。
适应性实验室进化
ALE以菌株GL01[29]为原始亲本菌株。挑取单菌落接种到Verduyn钠缓冲培养基中过夜培养。生长后的细胞用于接种五个独立的100 mL摇瓶，每瓶含20 mL添加400 mg/L AA（作为起始浓度，见结果部分）的相同培养基，起始OD600为0.1。培养物在Aquila生物振荡器中以30 °C、200 rpm培养24 h，配备实时光散射监测。24 h后，培养物以OD 0.1重新接种。柠檬酸-磷酸盐缓冲培养基在整个进化过程中维持pH 5的稳定，通过选定培养周期结束时的pH测量验证。当相应培养物在24 h培养期内完成葡萄糖相时，AA浓度以50或100 mg/L的梯度逐步提高。进化过程中的世代数通过每次传代起始和结束OD的对数差累加计算。细胞培养约50次连续传代，对应约215至231个世代。培养纯度通过荧光显微镜基于GL01中存在的GFP标记定期监测。每五天定期收集进化群体样品并保存于−80 °C。单克隆通过将50 µL培养物涂布在YPD G418琼脂平板上分离，每个群体随机挑取最多6个克隆进行进一步表征。
DNA提取、测序与分析
单分离株在YPD中过夜培养。使用Yeast DNA Extraction Kit（ThermoFisher Scientific）按相应方案提取基因组DNA。测序由Eurofins Genomics使用INVIEW Resequencing服务在Illumina NovaSeq X平台上进行，双端2 × 150 bp读长，平均覆盖深度约140×。获得的Illumina读段使用Breseq v0.34.1[59]分析，以bowtie2版本2.4.4[60]作为比对器，将读段比对到GL01的注释基因组[29]。Breseq以多态性模式运行，多态性频率截断值设为0.2，junction-alignment-pair-limit选项设为0（无限制）。通过将进化克隆检出的突变与起始菌株检出的突变进行比较，过滤假阳性。推测的染色体重复通过Breseq生成的覆盖度图中基因组区域读段覆盖度的一致性增加来识别。
途径筛选的酶选择
途径筛选的候选酶根据两个标准确定：[1] 已发表文献中对目标反应有充分记录的催化活性；[2] BRENDA数据库中报告的动力学参数。对于后者，选择具有相对有利动力学性质（如较低Km或较高kcat值）的酶，与其他已报道的催化相同或密切相关反应的酶进行比较。筛选所用的全部异源酶列表见补充表4。
途径筛选
挑取用于β-丙氨酸和3HP途径筛选的菌株（见补充表3）单菌落，从SD-URA平板接种到5 mL Delft培养基中，30 °C、200 rpm振荡培养16–48 h。主培养在100 mL摇瓶中进行，每瓶含20 mL相应测试培养基（见结果部分）。
研究结果
酿酒酵母对丙烯酸的耐受性评估
我们首先在不同pH条件下测试了酿酒酵母对AA的耐受性，在AA浓度50至1000 mg/L的培养基中测量生长。结果显示，AA在pH 6.5条件下对乙醇相有强烈抑制作用——从300 mg/L开始抑制生长，超过400 mg/L完全消除生长。这种效应在pH 6和pH 5时更为显著，乙醇相生长在更低浓度下即被完全抑制。此外，在pH 5和pH 6条件下，随着AA浓度升高，葡萄糖相也出现抑制效应（补充图1）。pH对有机酸毒性的影响已有充分文献记载，乙醇相生长的抑制也在丙酸等其他有机酸中观察到[24, 25]。然而，AA的抑制浓度显著低于丙酸或乙酸，这不能仅归因于酸度——AA的pKa（4.25）是这些酸中最低的（乙酸：4.76；丙酸：4.88）[10, 26]。毒性增强可能源于AA是一种高亲电性代谢物，通过烷基化破坏细胞功能，此前已证明AA能破坏大肠杆菌的脂肪酸循环[27]。当我们分析部分培养的发酵曲线时，意外发现野生型菌株在浓度高达150 mg/L时能快速降解AA（补充图2）。
丙烯酸耐受性的适应性实验室进化
为特异性筛选AA耐受性同时最小化pH相关影响，我们在pH 5条件下使用含0.15 M柠檬酸-磷酸盐缓冲液的培养基进行进化，此体系此前已建立[28, 29]。初步生长测试显示，CEN.PK113-7D在400 mg/L AA条件下的最大生长速率几乎减半（图2A），因此将该浓度作为ALE的起始浓度。从同一预培养物启动五个独立群体（ALE1-5），独立进化约50次连续传代。在1300 mg/L浓度下，葡萄糖相结束时转移的培养物重新接种后延迟期约24 h。值得注意的是，ALE4最终培养物中仅能回收两个克隆，两者的生长速率均低于其他群体的分离株。所有选定的分离株均能在1500 mg/L条件下生长（图2B），部分菌株对更高浓度也有耐受性（补充图3），而野生型无法生长。
由于野生型在低于150 mg/L的浓度下降解AA，我们关注进化突变体是否进化出在更高浓度下降解AA的能力。有趣的是，在所有条件下AA浓度保持稳定（数据未显示），表明进化突变体失去了降解AA的能力。
进化突变体的全基因组测序
为确定赋予AA耐受性的基因型，对进化突变体克隆（共25个克隆）进行了全基因组重测序。图2C显示了至少在两个独立进化群体中发生突变的基因概览（完整列表见补充表1）。然而，一些高频出现的靶点均显示相同的突变（YJR115W、NHA1、YLR466C-B、YKR040C和YNL179C），表明这些突变已在预培养物中发生，与耐受性表型无关。此外，YLR466C-B和NHA1的突变在此前使用相同缓冲培养基的进化中已有发现（29，未发表数据）。DBP2、CCC2和YNL190W的突变仅由部分读段支持，被认为不可靠。
ACH1的突变似乎至关重要——它出现在所有测序克隆中且突变类型多样。ALE2中所有克隆均有无义突变，以及G393E替换（该替换靶向活性位点，已被证明使该酶天然功能失活[30]），表明功能丧失是耐受性提高的原因。ACH1p是一种线粒体琥珀酰-CoA：乙酸CoA转移酶，具有额外的乙酰-CoA水解酶活性，通过将线粒体乙酰-CoA转化为乙酸促进其输出[30–32]。基于其功能和广泛的底物特异性[31]，ACH1p可能具有将CoA部分转移至丙烯酸生成丙烯酰-CoA的活性，而丙烯酰-CoA比游离酸毒性更强[33]。
ETR1中观察到的突变呈现有趣的模式——检测到三种不同的起始密码子突变变体（ATG → ATT、ATC或GTG）。对ETR1现有文献的分析表明，该突变可能导致负责将蛋白质靶向线粒体的8个氨基酸信号肽丢失[34]。同一作者还证明，N端信号肽缺失导致大部分蛋白质定位到胞质，但保留其NADPH依赖性2-烯酰硫酯还原酶活性和线粒体功能。由于AA是一种2-烯酸，错误定位的ETR1p可能作用于AA-CoA。
将YBR238C的缺失（通过移码或终止密码子插入）与AA耐受性联系起来比前述突变更困难。除定位于线粒体（与ACH1p和ETR1p类似）并参与线粒体功能和寿命外，YBR238Cp的功能知之甚少[35, 36]。其旁系同源物RMD9p调节线粒体基因表达和翻译[37–39]。YBR238C的缺失与线粒体DNA拷贝数改变和ATP水平升高相关[36]，可能促进AA输出。
CYC8在多个谱系中出现，与此前关于其他有机酸[40]或氯化钠[41]耐受性的报道一致。然而，本研究中观察到的突变主要位于可变CAA区域，增加或去除一个谷氨酰胺，因此推测其效应不显著。一个缺乏常见NHA1L246S突变的分离株携带CYC8W367C突变，提示其可能对钠耐受具有补偿作用。值得注意的是，CYC8p是一种转录共抑制因子，参与包括ETR1在内的多种基因的调控[42, 43]，与本研究中的其他突变相关联。
突变的反向工程以评估其效应
为确定哪些突变赋予AA耐受性，我们单独重构了最可能的突变变体，并对其所得菌株（ΔACH1、ETR1M1V、CYC8W367C和ΔYBR238C）进行进一步表型表征。在进化培养基中，CYC8W367C在无AA条件下使生长速率提高（图3A）。由于相对生长优势随培养基中AA浓度的升高而下降，我们得出结论……
途径筛选结果
摇瓶发酵
最终，在摇瓶中进行的分批发酵获得了30 mg/L的AA产量（图4A）。
讨论与解读
本研究通过ALE获得了对丙烯酸耐受性提高的酿酒酵母菌株，并鉴定了耐受性表型的遗传基础。结果表明，AA耐受性与线粒体功能直接相关。线粒体CoA转移酶ACH1的缺失显著提高了AA耐受性，而2-烯酰硫酯还原酶ETR1线粒体信号肽的去除进一步改善了耐受表型。此外，YBR238C作为单基因删除可提高AA耐受性的靶点被发现，但与ACH1缺失组合时未观察到叠加效应。除AA耐受性外，还证明ACH1是AA降解的主要执行者。
在耐受性工程之外，研究评估了不同生物合成途径直接发酵生产AA的潜力，确定β-丙氨酸途径最有前景。使用该途径，酵母中AA产量达30 mg/L（图4A）。
编译者解读
本研究的技术路线值得关注：先通过ALE在表型层面获得耐受菌株，再用全基因组测序锁定遗传靶点，最后通过反向工程验证因果关系——这种"进化→测序→重构"的策略在工业菌株开发中具有通用价值。线粒体代谢在有机酸耐受中的核心作用被清晰揭示，ACH1和ETR1作为工程靶点具有直接应用潜力。但30 mg/L的产量距离工业化甚远，β-丙氨酸途径的限速步骤和AA外排机制仍是瓶颈。后续研究若能结合代谢网络模型与转运蛋白工程，有望实现产量数量级的提升。
参考来源
Eisentraut L, Li X, Chen Y. Establishing Saccharomyces cerevisiae as a host for renewable acrylic acid production. Microb Cell Fact. PMID: 41781959. DOI: 10.1186/s12934-026-02974-3.
PMID: 41781959