来源：Biomed Microdevices | 编译：DNA Lab Space
导读
阻抗生物传感器将电化学阻抗谱与免疫反应特异性相结合，在病原体检测中具有无需标记、实时检测的优势。本研究通过计算机模拟预测对抗体CC12.1的单链抗原结合片段（scFab）进行定点突变，在酿酒酵母表面展示后制备纳米酵母（NY），构建了可检测SARS-CoV-2刺突蛋白的阻抗生物传感器，检出限达5 × 10⁻¹⁸ g/mL，并可在0.3至80 PFU/mL范围内区分病毒浓度，对H1N1流感和登革病毒具有选择性。
研究背景
新发病原体的不断出现以及慢性病和感染性疾病的增加，凸显了创新诊断技术的必要性。与传统方法相比，生物传感器无需精密设备和高度培训人员，可提供快速、准确、微创的检测手段，适合即时检测（PoC）应用。生物传感器整合化学、生物学和电子学原理，将生物反应转化为可测量的光学、电学或压电信号。为实现对特定疾病生物标志物的检测，需用探针（如单克隆或多克隆抗体、适配体、核酸或酶）对器件进行功能化。尽管抗体目前是抗原检测的金标准，但其生产和分离耗时且成本高昂，这推动了可快速、经济生产并保持靶抗原特异性的高质量亲和试剂的研究。重组抗体样分子——如单链抗原结合片段——为此提供了可行路径。
研究方法
材料：本工作所用引物均由巴西Exxtend公司合成。限制性内切酶NcoI、NotI和DpnI（10 U/µL）为FastDigest Thermo Scientific（美国）产品。脱氧核苷酸溶液（dNTPs）浓度为100 mM，购自New England Biolabs（美国）。DNA聚合酶方面，AccuPrime™ Pfx（2.5 U/µL）购自Invitrogen（Thermo Scientific，美国），PrimeStar HS（250 U）购自Takara Bio（日本），Phusion High Fidelity（2000 U/mL）购自New England Biolabs。GeneJET凝胶提取试剂盒和GeneJET PCR纯化试剂盒购自Thermo Scientific。DNA测序反应和纯化使用Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit，并以Big Dye XTerminator Purification Kit纯化，均购自Applied Biosystems（Thermo Scientific，美国）。
盐类、鲑鱼单链DNA（ss-DNA）、牛血清白蛋白（BSA）、氨基酸、尿嘧啶、葡萄糖、棉子糖、半乳糖、低分子量壳聚糖、50%戊二醛水溶液、含MgCl₂和CaCl₂的10 mM磷酸盐缓冲液（PBS，液体、无菌过滤、适用于细胞培养，pH 7.4）均购自Sigma-Aldrich。不含氨基酸的酵母氮碱基和酪蛋白氨基酸购自Becton, Dickinson and Company和USBiological Life Sciences（美国）。流式细胞术标记物链霉亲和素-藻红蛋白/Cyanine7（PE/Cyanine7）购自Biolegend（美国），抗V5标签抗体偶联iFluor 488购自Genscript（美国）。分析级溶剂购自Sigma-Aldrich、Exodo Científica或Synth（巴西）。SARS-CoV-2生物素化RBD（氨基酸序列为PDB ID: 7VYR的48至250位残基）购自Biolinker（巴西），刺突蛋白购自ABCAM（英国），H1N1重组病毒购自ProSpec（以色列），登革包膜蛋白-3购自Aviva Systems Biology（美国）。紫外线灭活的SARS-CoV-2病毒由巴西坎皮纳斯大学生物学研究所提供（Patterson et al. 2020）。
潜在残基位点突变的计算机模拟分析：CC12.1抗原结合片段（Fab）与RBD的相互作用基于从Protein Data Bank下载的晶体结构（PDB ID 6XC2；https://www.rcsb.org/sequence/6XC2）进行评估。通过删除水分子和双链制备结构。随后，使用Pymol选择Fab中与RBD残基边界区域的氨基酸残基。利用MutateX软件计算所选残基经计算机模拟突变为其他19种氨基酸后的自由能，范围设定为−3.0至5.0 kcal/mol（Tiberti et al. 2022）。
克隆与定点突变：CC12.1重链和轻链Fab序列（PDB ID 6XC2）由SynBio Technologies（美国）获得，并针对酿酒酵母表达进行密码子优化（补充信息图S1）。两链分别通过聚合酶链式反应（PCR）扩增，再经PCR融合形成柔性接头肽（SGGSTSGSGKPGSGEGSSGS），构建单链抗原结合片段（scFab）（Fan et al. 2015）。扩增反应在热循环仪（Analytik Jena，德国）中进行，反应体系包含：DNA模板溶液、AccuPrime™ Pfx DNA聚合酶（1 U）、200 µM dNTPs、各1 µM的正向和反向引物及10x缓冲液。用于克隆的引物（包括重叠引物）见补充表S1。融合PCR使用PrimeStar HS DNA聚合酶，先进行15个循环的无引物组装反应，再进行第二轮含正向和反向引物的全长片段扩增反应（Zhou et al. 2012）。根据需求，PCR产物直接纯化或使用相应GeneJET试剂盒进行琼脂糖凝胶提取。
该片段与凝集素2序列及N端血凝素标签（HA-tag）、C端SV5表位和六组氨酸标签框内插入酵母表达载体pYD4 [CEN/ARS PGAL1-AGA2-HA-SV5-6xHIS TRP1]（由美国加利福尼亚大学Jianlong Lou教授惠赠）。载体用NcoI和NotI限制性内切酶线性化，并通过醋酸锂法（Gietz and Schiestl 2007）与编码scFab的融合PCR产物同时转化入EBY100。CC12.1残基通过单引物反应进行定点突变（Edelheit et al. 2009），以克隆在pYD4中的亲本scFab序列为模板。SD引物列于补充表S2。简言之，SD扩增使用Phusion High Fidelity DNA聚合酶，热启动步骤为98 °C 1分钟，随后30个循环的98 °C 10秒、55 °C 30秒和72 °C 7分钟，最后72 °C延伸10分钟。随后，单链扩增产物通过从98 °C以1 °C/min逐渐降温至90 °C，再以10 °C/min降温至37 °C进行退火。DNA溶液经DpnI处理并转化入感受态大肠杆菌DH5α细胞。突变通过3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems，美国）测序确认，使用Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit并以Big Dye XTerminator Purification Kit纯化。
酵母培养与scFab诱导：携带CC12.1 scFab亲本和突变序列的重组DNA分别通过醋酸锂法（Gietz and Schiestl 2007）导入酿酒酵母EBY100（MATa AGA1::PGAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2Δ200 his3Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL，亦由Jianlong Lou教授惠赠），阳性转化子在无色氨酸合成完全培养基（SC-Trp，0.67%不含氨基酸的酵母氮碱基、0.2%不含色氨酸的氨基酸和尿嘧啶混合物、2%葡萄糖、2%琼脂）上筛选。为诱导scFab产生，酵母细胞首先在含酪蛋白氨基酸的合成葡萄糖培养基（SDCAA，0.67%不含氨基酸的酵母氮碱基、0.5%酪蛋白氨基酸、2%葡萄糖、0.54% Na₂HPO₄和0.856 g NaH₂PO₄·H₂O）中培养。培养后，细胞以600 nm光密度（O.D.₆₀₀，在DU800分光光度计（Beckman Coulter，美国）中测量）0.5重新接种于SR/GCAA培养基（0.67%酵母氮碱基、0.5%酪蛋白氨基酸、2%棉子糖、2%半乳糖、0.1%葡萄糖、0.54% Na₂HPO₄和0.856 g NaH₂PO₄·H₂O），在22 °C、200 rpm条件下培养约48小时（C25KC摇床培养箱，New Brunswick Scientific，美国）（Chao et al. 2006）。
酵母表面展示分析：共5 × 10⁷个酵母细胞用于流式细胞术酵母展示分析标记。方法详见文献（Chao et al. 2006），此处报告主要调整。用含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（1% PBSA，137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、1% BSA）封闭非特异性位点后，细胞与420 nM生物素化RBD在0.5% PBSA中室温温和旋转孵育1小时。后续步骤在4 °C进行。洗去未结合抗原后，使用PE/Cyanine7和抗V5标签抗体偶联iFluor 488标记RBD和scFab。细胞洗涤后重悬于0.5% PBSA中，通过FACSAria Fusion流式细胞仪（BD Biosciences）分析。平均荧光强度（MFI）仅对70,000个事件的单细胞捕获。酵母细胞自发荧光通过分析未结合RBD且未用荧光团标记的诱导细胞设定。scFab的存在通过评估i488标记细胞的MFI确认。scFab与RBD特异性相互作用的对照通过仅用PE/Cy7孵育的细胞和同时用两种荧光团孵育的细胞的MFI评估。RBD非特异性结合细胞的对照使用未诱导细胞、420 nM RBD和两种荧光团标记进行评估。
突变型scFab的筛选：对具有更高亲和力的突变型scFab，使用不同浓度的RBD进行筛选（原文此处截断，后续内容未在节选中完整呈现）。
研究结果
scFab CC12.1的计算机模拟成熟：对scFab中与RBD界面残基的分析提出了重链可变区（VH）48个点突变和轻链可变区（VL）29个点突变作为提高亲和力的候选位点。使用自由能（ΔΔG）评估RBD与每个被其他19种氨基酸替代的选定位置之间的相互作用（Tiberti et al. 2022）。预测有6个残基的特定突变可改善与RBD的相互作用，如表2所示，表中同时列出了ΔΔG值和Fab结构中的位置（见补充图S1）。其中VH中的3个残基分别位于链的互补决定区（CDRs）之一。在VL链中，1个残基位于CDR L1，2个位于CDR L3。正如预期，这些位置及其相应突变的有益ΔΔG位于或靠近与RBD残基主导相互作用的关键位点，200 ns模拟计算显示存在广泛氢键网络（Wang et al. 2021）。VH中丝氨酸31（Ser31）残基的预测突变可能改变相邻的天冬酰胺-酪氨酸（NY）基序，而VH中Ser53突变将改变丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸（SGGS）基序。这些基序共同决定了表位-抗体结合。CDR L1和L3对与RBD的氢键贡献较小（Wang et al. 2021; Yuan et al. 2020）。预测结果表明L1中有1个突变和L3中有2个突变靠近主要代表性残基。其中一个预测突变位于赖氨酸97（Lys97），该残基似乎与RBD的天冬氨酸形成不稳定的盐桥（Wang et al. 2021）。因此，将其突变为非极性甘氨酸可能代表相互作用稳定性的潜在提升。为选择具有更高RBD相互作用潜力的突变，采用酵母表面展示（YSD）技术评估亲本和突变型scFab CC12.1的亲和力。
表2 突变残基位点的有利自由能及计算的RBD Kd值
| 突变 | 位置 | ΔΔG (kcal/mol) | 结合分数倍数变化（突变体/亲本） | 计算Kd |
|------|------|-----------------|-------------------------------|--------|
| 亲本序列 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 1808.2 ± 34.6 nM |
| Ser31Asn | CDR H1 | −1.25 | 7630.81 | 未测试 |
| Ser53Glu | CDR H2 | −1.99 | 8931.55 | 478.1 ± 140.3 nM |
| Ser53Asp | CDR H2 | −1.60 | 2290.91 | 未测试 |
| Asp97Leu | CDR H3 | −1.99 | 8440.79 | 未测试 |
| Asp97Pro | CDR H3 | −2.33 | 5241.72 | 441.1 ± 66.6 nM |
| Ser31Tyr | CDR L1 | −0.09 | 1071.49 | 418.2 ± 72.2 nM |
| Pro95Ala | CDR L3 | 0.05 | 1770.66 | 未测试 |
| Lys97Gly | CDR L3 | −0.86 | 2911.34 | 477.6 ± 130.1 nM |
n.a.：不适用；n.t.：未测试，因为突变体的抗原结合分数相对于亲本序列的倍数变化小于1.0
酵母表面展示（YSD）指导选择更高亲和力的突变体：对抗体-抗原相互作用和能量有利突变的计算机模拟预测减少了对广泛且昂贵实验的需求，否则需要在实验室中生成和测试大量突变体（Huang et al. 2022）。根据MutateX计算的ΔΔG，选择自由能较高的残基（CDR H2 Ser53Glu、H3 Asp97Pro、L1 Ser31Tyr和L3 Lys97Gly）分别构建突变型scFab，并在酿酒酵母中表达，通过流式细胞术测量其与RBD的相互作用。在YSD技术中，CC12.1亲本序列的scFab与细胞壁蛋白凝集素2（Aga2）的C端融合克隆。SV5表位标签位于VL链C端，两链通过柔性肽接头连接（Fan et al. 2015）。PCR突变在最终质粒构建体pYD4-scFab_CC12.1 [CEN/ARS PGAL1-AGA2-HA-scFab_CC12.1-SV5-6xHIS TRP1]中进行。
在酿酒酵母中，Aga2与交配α-凝集素Aga1蛋白结合，从而将scFab暴露于细胞外侧。Aga1序列在染色体上被工程化设计，在半乳糖1启动子（PGAL1）下过表达。Aga2同样如此，由着丝粒质粒表达。这使得每个细胞约有5 × 10⁴个scFab。通过结合抗体偶联荧光团（i488）检测构建体中的一个SV5标签，可在流式细胞术分析中标准化scFab表达。与抗原RBD的相互作用通过使用链霉亲和素（也偶联荧光团Cy7）检测偶联至RBD的生物素来确定（Angelini et al. 2015; Kang et al. 2022）。使用流式细胞术确认突变体与CC12.1亲本序列相比维持了相互作用和功能性。评估时，10⁶个细胞与RBD分子数相比scFab平均数10倍过量的RBD孵育。为量化抗原-抗体相互作用，计算双阳性群体中PE/Cy7与i488的MFI比值。该比值代表抗原结合分数，有效将结合的RBD量标准化至scFab表达水平。通过考虑scFab表达的细胞间变异性，该方法将蛋白密度与结合亲和力解耦，确保高表达但低固有亲和力的突变体不会被误认为阳性命中。随后将突变体性能与亲本CC12.1克隆进行比较（表2）；仅结合分数高于1.0（相对于亲本scFab标准化）的突变体被优先用于剂量-响应滴定曲线。随后，应用相同技术测量不同[RBD]滴定曲线中双阳性事件的MFI。这使得能够通过计算Kd来估计抗体亲和力，因为流式细胞术可用于筛选具有改善相互作用的抗体突变体（Chao et al. 2006; Cherf and Cochran 2015; VanAntwerp and Wittrup 2000）。
根据表2中计算的Kd，亲本CC12.1 scFab对RBD的Kd为808 ± 35 nM。另一方面，突变体通常表现出约两倍的亲和力改善，其中CDR H3中的Asp97Pro和L1中的Ser31Tyr与亲本CC12.1相比具有统计学显著性（p ≤ 0.05）。CC12.1不同突变体的筛选、亲和力和病毒中和潜力通过YSD结合流式细胞术获得，以选择对RBD具有改善亲和力的Fab突变体（Zhao et al. 2022）。亲和力改善的突变体在重链和轻链中至少有两个CDR发生突变。解离常数和其他常数使用纯化的突变抗体和表面等离子体共振方法测量。由于这些Fab具有多个突变位点，抗体以完整纯化形式进行了测试。该评估蛋白-蛋白相互作用的方法与本研究不同，其报道的亲和力值低于本工作计算的值。Zhao等人（2022）发现，最有效的CC12.1突变抗体能够中和原始SARS-CoV-2及其关切变异株，该抗体在CDR L1的Ser31处有突变，同时在另外五个CDR中各有一个突变。该残基被突变为色氨酸——一种非极性但体积大的氨基酸，而酪氨酸（极性）则是我们突变体中预测且结果更佳的氨基酸。因此，即使仅有一个突变，我们的结果也提供了一个有前景的CC12.1相互作用突变体，并将其应用于生物传感器检测SARS-CoV-2。
纳米酵母表征：我们的目标是通过仅生产检测组件——即抗原结合片段——展示在碎片化酵母细胞表面，来克服抗体昂贵生产和纯化的难题，如先前工作所述（Farokhinejad et al. 2021; Li et al. 2023）。因此，在诱导scFab CC12.1突变体Ser31Tyr表达后生成纳米酵母（NY）。通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）对其表征，结果如图1所示。NTA基于流体动力学性质提供平均粒径、浓度和Span指数（Ribei...（原文截断）
（原文此处截断，后续结果内容未在节选中完整呈现）
讨论与解读
本研究展示了新型NY-scFab CC12.1抗体变体的开发，将计算机模拟理性设计与锚定在纳米碎片酵母表面的scFab构建体相结合。该创新方法能够精确识别增强SARS-CoV-2 RBD结合亲和力的突变。通过使用scFab片段替代全长单克隆抗体（mAbs），引入了更稳定、生产更快、成本更低的生物识别元件，其保持了高功能完整性并可用于诊断。该高性能阻抗生物传感器的开发为病毒检测灵敏度设立了新基准。突变型scFab使SARS-CoV-2刺突蛋白的检出限达到5 × 10⁻¹⁸ g/mL。与现有文献中使用传统单克隆抗体的类似阻抗免疫传感器相比，该平台的检出限低两个数量级。这一显著改进凸显了scFab片段在传感器表面提供的优越取向和结合位点密度。此外，该生物传感器可区分浓度低至0.3 PFU/mL的灭活SARS-CoV-2，同时对H1N1重组流感病毒和登革包膜蛋白-3的阻抗值与纯PBS溶液相当，保持了高选择性。这些结果证实了其在复杂生物基质中的可靠性。
编译者解读：该研究巧妙地将计算机模拟抗体工程与酵母表面展示技术衔接，以单点突变实现了亲和力约两倍的提升，并将酵母细胞碎片（NY）直接作为传感界面——省去了抗体纯化步骤，这是合成生物学"用细胞做材料"思路的典型体现。从应用角度看，将识别元件锚定在纳米颗粒表面而非传统化学固定抗体，可能改善了取向一致性和结合位点密度，这或许是检出限比传统抗体传感器低两个数量级的原因。不过，UV灭活病毒与真实临床样本之间存在差距，且当前工作未展示在鼻咽拭子或血清等复杂基质中的验证，距临床转化仍有距离。未来若能将此平台拓展至其他病原体检测，其"即插即用"的模块化优势将更为突出。
参考来源
Hensel RC, Materón EM, Macedo AJG, Raimundo BVB, Kadowaki MAS. Nanoyeast-based impedimetric biosensor with mutated single chain antigen-binding fragment anchoring for SARS-CoV-2 detection. Biomed Microdevices. PMID: 41770397. DOI: 10.1007/s10544-026-00799-w.
PMID: 41770397