来源：bioRxiv | 编译：DNA Lab Space
一类藏在植物里的“分子手铐”——环肽生物碱，长久以来只能靠化学合成获取。2025年，美国研究团队从中国枣树中挖出了它的全套生物合成基因，打通了从核糖体肽到止痛、抗焦虑分子的天然流水线。这项发表于预印本平台bioRxiv的工作，首次报道了经典环肽生物碱的完整生物合成途径，并成功实现了异源重组与分子多样化改造。
研究背景
环肽生物碱是植物肽类天然产物中一个不断扩大的家族，其结构核心是一个由酪氨酸衍生酚介导的大环醚交联。经典环肽生物碱以13至15元环的张力环蕃结构为特征，末端还带有N-甲基化和C端苯乙烯胺等修饰。这类分子在植物中含量低、结构复杂，化学合成路线虽已建立多年，但生物合成途径始终是空白——没人知道植物究竟如何“组装”出这些环状分子。
枣属植物（Ziziphus）是环肽生物碱的富集来源，adouetine X、sanjoinine A等药用分子均分离自该属。其中，sanjoinine A具有抗焦虑活性，adouetine X则有镇痛作用。然而，这些分子的体内合成机制长期悬而未决。Chekan等人此前通过生物信息学分析，在枣树基因组中锁定了13元和14元环肽生物碱的候选分裂前体基因，这些基因与BNM2亚家族的BURP结构域编码基因共定位。这一线索指向一类名为“burpitide”的前体肽系统——BURP蛋白可能催化前体肽的大环化。
本研究正是从这条线索出发，以中国枣树（Ziziphus jujuba）为材料，系统解析了14元环肽生物碱lotusine A的完整生物合成途径，并揭示了三种关键酶的分工协作。
研究方法
植物材料与培养条件
供试植物为本氏烟（Nicotiana benthamiana），种子播种于Premier Horticulture Pro Mix HP High Porosity with Mycorrhizae基质中，在植物生长灯下以16小时光照/8小时黑暗的光周期、室温条件下培养4至12周。幼苗在一周后移栽至添加Osmocote缓释肥的更大花盆中。枣树（Z. jujuba）幼嫩茎叶作为基因克隆材料。美洲茶（Ceanothus americanus）干燥根购自Starwest Botanicals。
化学试剂与仪器
除特别注明外，所有化学试剂均购自Thermo Fisher Scientific Inc.。LC-MS级溶剂为Fisher Scientific Inc.的Optima品牌。sanjoinine A标准品（从Ziziphus cambodiana Pierre.分离，货号HY-119637）购自MedChemExpress。合成基因片段由Twist Biosciences Inc.提供。脱氧核苷酸引物购自Integrated DNA Technologies Inc.。
液相色谱-质谱联用分析在Thermo QExactive Orbitrap质谱仪上进行，耦联Vanquish超高效液相色谱系统。数据用Thermo Xcalibur软件包（v4.3.73.11）中的QualBrowser模块处理。制备型和半制备型高效液相色谱在Shimadzu HPLC系统上进行，配备两台二元LC20-AP泵、DGU-403脱气机、SPD-20A紫外-可见光检测器和FRC-10A馏分收集器。核磁共振分析在Bruker Ascend 800 MHz核磁共振波谱仪上进行，配备5mm三共振反相检测TCI CryoProbe探头，数据用MestReNova（v14.0.0，Mestrelab Research）处理。
候选基因筛选与载体构建
研究团队聚焦枣树品种“冬枣”的第9号染色体。该染色体上有一个BURP结构域编码基因与候选前体基因共定位。这个前体基因预测含有11个FPIY核心肽和3个FLIY核心肽。FPIY序列与已知的14元环肽生物碱lotusine A以及13元环的daechuine S相匹配。
为了验证BURP基因是否编码分裂型burpitide环化酶，团队合成并克隆了一个截短版前体基因——包含5个FPIY核心肽重复，命名为ZjuPrec-5xFPIY。该基因通过pEAQ-HT质粒载体，经农杆菌浸润法在本氏烟中瞬时表达，侵染后培养7天。
体内表达与产物检测
转基因本氏烟叶片经甲醇提取后，用LC-MS检测是否有单环FPIY肽段生成。对照实验单独表达前体基因，观察能否自发环化。后续共表达实验则将前体基因与候选BURP环化酶基因同时转入本氏烟，检测环化产物是否出现。
体外酶学反应
对于非血红素铁和2-酮戊二酸依赖性氧化脱羧酶以及SAM依赖性N-甲基转移酶，研究采用体外酶促反应验证其功能。具体反应体系参数——包括酶浓度、底物浓度、辅因子添加量、反应温度和时间——原文摘要未详述具体参数。产物通过LC-MS和NMR进行结构鉴定。
化学酶法合成与多样化
研究将枣树来源的酶与一种石松（clubmoss）环肽生物碱环化酶组合使用，通过体内（本氏烟共表达）和体外（纯酶催化）相结合的策略，对镇痛分子adouetine X和抗焦虑分子sanjoinine A进行生物合成与结构多样化改造。
研究结果
burpitide环化酶的鉴定
单独表达ZjuPrec-5xFPIY前体基因时，本氏烟叶片甲醇提取物中未检测到与单环FPIY肽段对应的分析物。这说明前体肽自身不能自发环化，需要酶催化。
当将前体基因与候选BURP结构域基因共表达后，检测到了环化产物——证明该BURP基因编码的酶确实是一个分裂型burpitide环化酶，能够催化FPIY核心肽的大环化。该酶被命名为ZjuBURP。这是首次在枣树中鉴定到催化环肽生物碱大环化步骤的酶。
C端氧化脱羧酶的发现
环肽生物碱的C端苯乙烯胺结构是其特征性修饰之一。研究团队发现，这一结构来源于非血红素铁和2-酮戊二酸依赖性酶的氧化脱羧反应。该酶作用于环化后的肽底物，将C端氨基酸氧化脱羧，生成带有羟基苯乙烯胺结构的产物。这一发现将非血红素铁和2-酮戊二酸依赖性酶的催化谱系拓展到了肽类氧化脱羧反应——此前这类酶已知的功能包括羟基化、卤化、环化等，但氧化脱羧作为其天然催化功能尚属首次报道。
N端二甲基化的实现
环肽生物碱的N端通常带有α-N,N-二甲基修饰。研究鉴定到SAM依赖性N-甲基转移酶负责这一步骤，该酶以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，对前体肽N端进行两次连续甲基化，生成N,N-二甲基化产物。
完整途径重构与产物验证
将上述三种酶——ZjuBURP环化酶、非血红素铁/2-酮戊二酸依赖性氧化脱羧酶、SAM依赖性N-甲基转移酶——与本氏烟表达系统组合，研究团队成功重构了14元环肽生物碱lotusine A的完整生物合成途径。终产物经LC-MS和NMR确证结构正确。
异源组合与分子多样化
团队进一步将枣树酶与石松来源的环肽生物碱环化酶联用，在本氏烟体内和体外反应两种模式下，成功合成了镇痛分子adouetine X和抗焦虑分子sanjoinine A。这一结果证明，不同植物来源的环化酶与修饰酶可以交叉组合，实现目标分子的定向生物合成。
值得注意的是，研究使用的sanjoinine A标准品分离自柬埔寨枣（Ziziphus cambodiana），而美洲茶干燥根也作为植物材料被用于相关实验——这暗示研究团队可能尝试了从其他植物组织中直接提取或转化底物，原文摘要未详述具体实验参数。
生物合成途径全景
综合实验结果，14元环肽生物碱lotusine A的生物合成途径可概括为：核糖体合成前体肽（含FPIY等核心序列）→ ZjuBURP环化酶催化大环化（形成14元环醚交联）→ 非血红素铁/2-酮戊二酸依赖性酶催化C端氧化脱羧（生成羟基苯乙烯胺）→ SAM依赖性甲基转移酶催化N端α-N,N-二甲基化。三步酶促反应完成了从线性前体肽到成熟环肽生物碱的全部转化。
讨论与展望
这项研究填补了经典环肽生物碱生物合成途径的空白。此前，这类分子的获取完全依赖化学合成——路线长、步骤多、总产率低。如今，植物体内的“原装生产线”被完整解析，三条酶促反应链清晰可辨。
从酶学角度看，非血红素铁和2-酮戊二酸依赖性酶家族又添新成员。这类酶在自然界中催化反应类型极为多样，但氧化脱羧作为其天然催化功能尚属首次报道。这一发现拓展了人们对这个古老酶家族催化潜力的认知边界。
从应用角度看，研究团队将枣树酶与石松环化酶进行跨物种组合，成功生产了两种具有明确药理活性的分子——镇痛剂adouetine X和抗焦虑剂sanjoinine A。这种“酶工具箱”式的策略，为14元环肽生物碱的规模化代谢工程和化学酶法合成铺平了道路。
当然，从预印本到正式发表，数据仍需同行评议检验。当前工作主要在本氏烟瞬时表达体系中完成，稳定转基因体系的建立、酶动力学参数的精细测定、以及更多底物谱的拓展，原文摘要未详述具体参数。但无论如何，这条从枣树基因组出发、抵达药用分子的完整路线图，已经为环肽生物碱的绿色制造打开了一扇门。
参考来源
Hungerford J, Mydy LS, Wang X, Mendoza-Perez L, Ousley DA. Biosynthesis of 14-membered cyclopeptide alkaloids via non-heme-iron- and 2-oxoglutarate-dependent oxidative decarboxylation. bioRxiv. PMID: 41648217.
PMID: 41648217