来源：Sci Rep | 编译：DNA Lab Space
导读
甲基营养酵母Komagataella phaffii（原名Pichia pastoris）在从甲醇碳源切换至葡萄糖后，多种甲醇诱导酶会迅速降解。本研究聚焦两种胞浆酶——甲醛脱氢酶（Fld1）和甲酸脱氢酶（Fdh1），通过构建GFP融合表达菌株及ATG基因缺失突变体，结合酶活测定、Western blot和荧光显微镜技术，证实了Atg1、Atg6和Atg15参与这两种胞浆酶向液泡的降解过程。研究揭示选择性自噬在碳源切换引发的蛋白质组重塑中发挥关键作用。
研究背景
真核细胞的蛋白质稳态依赖于合成与降解之间的精密平衡。两条主要降解途径维持这一平衡：泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬-溶酶体/液泡途径。蛋白酶体主要降解短寿命调节蛋白和错误折叠肽段，而自噬则负责将长寿命蛋白、蛋白聚集体乃至完整细胞器运送至液泡中降解。自噬相关基因（ATG）编码自噬过程必需的蛋白质。自噬可分为微自噬和巨自噬两类，两者均包含非选择性和选择性过程。微自噬通过溶酶体膜内陷或突起直接包裹货物；巨自噬则将胞质成分包裹在新形成的双层膜自噬体中，随后与溶酶体融合降解。在K. phaffii中，碳源转换可诱导不同的自噬途径：从甲醇切换至葡萄糖诱导微自噬（主要是微过氧化物酶体自噬），而切换至乙醇则触发巨自噬。
研究方法
菌株与培养基
本研究使用K. phaffii菌株GS200（his4 arg4）、SMD1163（his4 pep4 prb1）和gss1Δ，均来源于同一亲本菌株GS115（his4）。细胞在YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1%葡萄糖）或添加甲醇（0.5%）、乙醇（1%）或葡萄糖（2%）作为碳源的YNB（0.67%酵母氮碱，Difco）无机培养基中培养。营养缺陷型菌株在无机培养基上生长时需添加相应生长因子：L-组氨酸50 mg/L、L-精氨酸50 mg/L。所有固体培养基含2%琼脂。K. phaffii菌株在28°C、220 rpm条件下培养。大肠杆菌DH5α菌株在需要细菌宿主的实验中使用，于37°C在LB培养基中培养。转化后的大肠杆菌细胞在含100 mg/L氨苄青霉素或50 mg/L诺尔丝菌素（NTC）的丰富培养基中维持。
生化方法与分析
酵母细胞在YPD培养基中过夜培养，随后转移至新鲜YPD培养基继续孵育6 h。离心收集细胞，用水洗涤两次，转移至含1%甲醇的培养基中诱导甲醇分解代谢酶Fld1和Fdh1，孵育18–23 h。为启动目标蛋白降解，将细胞以OD600为0.5转移至含2%葡萄糖的新鲜培养基中。酵母生物量使用Helios Gamma分光光度计（OD，600 nm；比色皿，10 mm）浊度法测定，并进行重量法校准。
Fld1和Fdh1活性测定参照已发表方法并稍作修改。测定Fld1和Fdh1比活力时，酵母细胞在YNB培养基中培养至对数中期，使用玻璃珠制备无细胞提取物。蛋白质浓度采用Lowry法以牛血清白蛋白为标准测定。Fld1活性在以下反应混合物（1 mL）中测定：1 mM甲醛、1 mM NAD+和2 mM谷胱甘肽，溶于100 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0）。Fdh1活性在以下反应混合物（1 mL）中评估：200 mM甲酸钠和2 mM NAD+，溶于100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.5）。反应通过向混合物中添加浓度为0.1 mg/mL的无细胞提取物启动，测定340 nm波长处消光值变化的动力学。该波长对应烟酰胺辅因子的峰值吸收。Fld1和Fdh1活性按以下公式计算：U/mL酶活 =（OD340/min）/（6.22 × mg酶/mL反应混合物），其中OD340/min为单位时间（min）内340 nm波长处消光值的变化；6.22为烟酰胺辅因子的消光系数。
Aox1活性根据甲醇反应中过氧化氢生成速率测定，通过辣根过氧化物酶存在下邻联茴香胺的过氧化氧化进行监测。为可视化酵母菌斑中的Aox1活性，细胞先在含甲醇的YNB培养基上预培养，然后复制平板至含葡萄糖的固体YNB培养基。孵育8 h后，通过覆盖含透化剂的Aox1反应混合物可视化Aox1活性。
Western blot分析按先前描述的方法使用抗绿色荧光蛋白（GFP）抗体进行。用于Western blot分析的蛋白样品在葡萄糖适应0、6和24 h时制备。分析样品使用12.5%三氯乙酸制备，并与β-巯基乙醇共煮沸。抗原-抗体复合物通过增强化学发光法检测。
Phloxine B评估酵母活力
突变菌株在YPD培养基中于28°C、220 rpm振荡培养18–24 h。细胞用无菌水洗涤两次，接种至氮饥饿YNB培养基（0.17%不含硫酸铵和氨基酸的酵母氮碱和2%葡萄糖）中以在28°C、220 rpm振荡下启动一般自噬。使用Phloxine B染色评估酵母活力。在氮饥饿条件下培养24 h后，酵母细胞用Phloxine B溶液染色至终浓度2 µg/mL。Phloxine B染色反映死细胞百分比。使用带红色滤光片的荧光显微镜估计染色的死细胞。GS200/FLD1-GFP或GS200/FDH1-GFP和SMD1163分别用作阴性和阳性对照菌株。定量评估死细胞时，使用激发波长540 nm和发射波长564 nm记录Phloxine B荧光。荧光强度使用荧光分光光度计（RF-6000，Shimadzu，京都，日本）测量。荧光在OD600调至0.2的酵母细胞水悬浮液中测定。
质粒与菌株构建
FLD1、FDH1、ATG1、ATG6和ATG15基因序列从巴斯德毕赤酵母基因组数据库提取。
含FLD1启动子和FLD1开放阅读框（2292 bp）的DNA片段通过PCR使用引物对Ko1016/Ko1017和K. phaffii基因组DNA为模板获得。含GFP基因的载体（7518 bp）通过PCR使用引物Ko1019/Ko1018和质粒pPN6-GFP为模板扩增。所得片段通过Gibson Assembly组合成单一质粒。表达K. phaffii FLD1与GFP融合的质粒命名为pPN6-FLD1-GFP。
同样方式，含自身启动子的FDH1基因（2141 bp）通过PCR使用引物对Ko1021/Ko1022和K. phaffii基因组DNA为模板扩增。含GFP基因的载体（7497 bp）通过PCR使用引物Ko1023/Ko1024和质粒pPN6-GFP为模板扩增。所得片段通过Gibson Assembly组合成单一质粒。表达K. phaffii FDH1与GFP融合的质粒命名为pPN6-FDH1-GFP。
K. phaffii GS200和SMD1163（自噬途径缺陷菌株）受体菌株通过电穿孔法转化质粒pPN6-FLD1-GFP和pPN6-FDH1-GFP。转化前，质粒pPN6-FLD1-GFP和pPN6-FDH1-GFP分别用SalI和SacI线性化。含质粒转化子的选择在不含组氨酸的无机培养基上进行。构建菌株GS200/FLD1-GFP、SMD1163/FLD1-GFP、GS200/FDH1-GFP和SMD1163/FDH1-GFP基因组中相应质粒的存在通过PCR确认。
为构建ATG1、ATG6和ATG15基因缺失菌株，构建相应缺失 cassette。ATG1、ATG6和ATG15基因的5'部分分别使用引物对Ko1268/Ko1269、Ko1276/Ko1277和Ko1282/Ko1283从K. phaffii基因组DNA PCR扩增，3'部分使用Ko1270/Ko1271、Ko1278/Ko1279和Ko1284/Ko1285扩增。骨架质粒pUC57使用引物Ko1264/Ko1265扩增。相应5'和3'片段与pUC57通过Gibson Assembly组装生成中间质粒。随后，赋予NTC抗性的选择性标记natNT2从质粒pFMN1-rosB-NAT使用引物Ko1266/Ko1267扩增，插入中间载体的BamHI和SalI位点，所得质粒命名为pATG1Δ、pATG6Δ和pATG15Δ。
含缺失cassette的PCR片段分别使用引物Ko1268/Ko1271、Ko1276/Ko1279和Ko1282/Ko1285从质粒pATG1Δ、pATG6Δ和pATG15Δ扩增。PCR片段转化入GS200/FLD1-GFP和GS200/FDH1-GFP。
研究结果
Fld1和Fdh1的降解途径
Fld1和Fdh1是研究甲基营养酵母胞浆蛋白降解的重要模型蛋白。在这一过程中，甲醇被Aox1氧化为甲醛，随后由Fld1转化为甲酸，最后Fdh1催化甲酸氧化为二氧化碳。将甲基营养生长的细胞转移至葡萄糖培养基后，Fld1和Fdh1的比活力迅速下降。研究考察了野生型菌株K. phaffii GS200、液泡蛋白酶缺陷菌株（SMD1163）和葡萄糖感知受损菌株（gss1Δ）中Fld1和Fdh1的失活情况。SMD1163中液泡蛋白酶活性降低损害了液泡融合后自噬体的最终降解步骤，导致未降解货物积累和过氧化物酶体蛋白的延长保留。gss1Δ菌株缺乏葡萄糖传感器Gss1，该传感器参与葡萄糖分解代谢物阻遏并参与K. phaffii过氧化物酶体自噬降解的调控。将细胞从甲醇转移至葡萄糖后，SMD1163和gss1Δ菌株中Fld1和Fdh1的比活力比野生型菌株至少高两倍（图1a、b），表明这些酶通过液泡途径降解。模型过氧化物酶体酶Aox1观察到类似但差异更明显的趋势，突变体中活性在从甲醇转移至葡萄糖后比野生型高约十倍（图1a、b）。Aox1的降解已被报道通过自噬途径发生。Fld1和Fdh1的比活力也在GS200和SMD1163菌株从甲醇转移至乙醇后测定。与葡萄糖适应不同，乙醇适应在转移后6 h内不改变Fld1或Fdh1活性（图1c）。相比之下，GS200中Aox1活性迅速下降，与葡萄糖适应后观察到的下降相似。SMD1163菌株在乙醇和葡萄糖适应期间均观察到Aox1活性的延迟（图1），与Tuttle和Dunn先前观察到的结果一致。
为验证酶活性测定得出的结论，按材料与方法部分所述构建了目标酶与GFP融合表达的菌株。随后通过Western blot和荧光显微镜评估GS200/FLD1-GFP、SMD1163/FLD1-GFP、GS200/FDH1-GFP和SMD1163/FDH1-GFP菌株中Fld1和Fdh1的降解。Western blot分析结果显示，GS200/FLD1-GFP和GS200/FDH1-GFP细胞从甲醇转移至葡萄糖后24 h，Fld1和Fdh1发生完全降解（图2）。然而，SMD1163/FLD1-GFP和SMD1163/FDH1-GFP中Fld1和Fdh1的降解因液泡蛋白酶阻断而受损，表明Fld1和Fdh1的降解通过液泡途径发生。
为可视化Fld1和Fdh1的降解，在荧光显微镜下观察GS200/FLD1-GFP、SMD1163/FLD1-GFP、GS200/FDH1-GFP和SMD1163/FDH1-GFP菌株的细胞。在甲醇培养基中孵育后，所有菌株的细胞在细胞质中呈现分散的绿色发光，确认了Fld1-GFP和Fdh1-GFP融合蛋白的胞浆定位（图3）。GS200/FLD1-GFP和GS200/FDH1-GFP细胞从甲醇转移至葡萄糖后24 h，GFP荧光消失。同时，SMD1163/FLD1-GFP和SMD1163/FDH1-GFP菌株在转移至葡萄糖后仍保留荧光（图3）。这些发现得到细胞悬浮液荧光测量的进一步支持，结果显示转移至葡萄糖后SMD1163/FLD1-GFP和SMD1163/FDH1-GFP菌株的GFP信号显著高于GS200/FLD1-GFP和GS200/FDH1-GFP。具体而言，荧光强度分别增加了5.7倍和5.5倍。所得结果证实了Fld1和Fdh1的液泡降解，与Western blot和酶活性测定结果一致。
atg1Δ、atg6Δ和atg15Δ对Fld1和Fdh1降解的影响
酵母自噬机制已有广泛研究，自噬的分子机制及该过程必需的基因已被鉴定。研究考察了破坏自噬不同阶段相关基因对Fld1和Fdh1降解的影响。选择了ATG1（自噬起始和囊泡形成所必需）、ATG6（参与自噬体形成）和ATG15（与液泡中自噬体破裂相关）基因。在GS200/FLD1-GFP和GS200/FDH1-GFP背景下删除ATG1、ATG6和ATG15基因，构建了菌株GS200/FLD1-GFP/atg1Δ、GS200/FLD1-GFP/atg6Δ、GS200/FLD1-GFP/atg15Δ、GS200/FDH1-GFP/atg1Δ、GS200/FDH1-GFP/atg6Δ、GS200/FDH1-GFP/atg15Δ。
自噬缺陷突变体的常见表型是在饥饿条件下孵育时活力降低。因此，使用Phloxine B测定评估了所构建atg突变体在诱导一般自噬的氮饥饿条件下的活力。Phloxine B是一种红色染料和荧光素衍生物，活酵母细胞将其排除在外，但细胞死亡且质膜完整性受损后可穿透并染色胞质成分。亲本菌株GS200/FLD1-GFP和GS200/FDH1-GFP用作阳性对照，液泡蛋白酶缺陷的SMD1163菌株用作阴性对照。氮饥饿一天后，Phloxine B处理细胞的荧光分析显示所有atg突变体的一般自噬均受损。atg6Δ的荧光强度与SMD1163相当，而atg1Δ和atg15Δ的荧光比SMD1163低约三倍，比GS200高三倍。因此，atg1Δ和atg15Δ的一般自噬受损，atg6Δ受损更严重，与先前报道的atg1Δ数据一致。荧光显微镜进一步支持这些发现，显示atg6Δ的自噬受损最强，atg1Δ和atg15Δ与对照菌株相比缺陷较轻。氮饥饿导致atg6Δ菌株中近100%的细胞被染色，与SMD1163相似。
使用无细胞提取物中的Aox1测定研究构建突变体中的微过氧化物酶体自噬。GS200/FLD1-GFP/atg1Δ、GS200/FLD1-GFP/atg6Δ、GS200/FLD1-GFP/atg15Δ、GS200/FDH1-GFP/atg1Δ、GS200/FDH1-GFP/atg6Δ、GS200/FDH1-GFP/atg15Δ菌株中Aox1的比活力在从甲醇转移至葡萄糖后0、6、24 h测定。与对照菌株GS200/FLD1-GFP和GS200/FDH1-GFP相比，atg突变体中Aox1活性下降延迟（图4a）。AOX活性也在葡萄糖适应8 h后通过菌斑覆盖法可视化（图4b）。这些结果表明所构建的atg突变体中微过氧化物酶体自噬受损。
在atg突变体中测定了Fld1和Fdh1的比活力。GS200/FLD1-GFP/atg1Δ、GS200/FLD1-GFP/atg6Δ、GS200/FLD1-GFP/atg15Δ菌株在从甲醇转移至葡萄糖后0、6、24 h的Fld1比活力如图5a所示。GS200/FDH1-GFP/atg1Δ、GS200/FDH1-GFP/atg6Δ、GS200/FDH1-GFP/atg15Δ菌株在相同条件下Fdh1的比活力如图5b所示。所有atg突变体在转移后24 h均保留了比对照菌株更高的Fld1和Fdh1活性。Western blot分析显示，atg1Δ、atg6Δ和atg15Δ突变体中Fld1和Fdh1的降解受损（图5c、d），与酶活性测定结果一致。
荧光显微镜观察GS200/FLD1-GFP、GS200/FLD1-GFP/atg1Δ、GS200/FLD1-GFP/atg6Δ、GS200/FLD1-GFP/atg15Δ及GS200/FDH1-GFP、GS200/FDH1-GFP/atg1Δ、GS200/FDH1-GFP/atg6Δ、GS200/FDH1-GFP/atg15Δ菌株在甲醇培养基生长后转移至葡萄糖培养基以刺激Fld1和Fdh1降解的荧光图像。对照菌株GS200/FLD1-GFP和GS200/FDH1-GFP在转移至葡萄糖后24 h GFP荧光消失，而atg突变体保留明显的胞浆GFP荧光（图6）。
讨论与解读
在K. phaffii中，碳源转换引发不同的自噬途径。从甲醇切换至葡萄糖诱导微自噬（主要为微过氧化物酶体自噬），液泡膜内陷或形成指状延伸直接包裹过氧化物酶体并隔离至液泡腔内降解。从甲醇切换至乙醇则触发巨自噬（巨过氧化物酶体自噬），单个过氧化物酶体先被包裹在双层膜自噬体中，随后与液泡融合。基于Fld1和Fdh1在乙醇和葡萄糖适应期间的活性测定，可以得出结论：这些酶通过微自噬途径降解。目前，葡萄糖适应和微自噬过程中Fld1和Fdh1识别与隔离的确切机制尚不清楚，可能机制包括Fld1和Fdh1在过氧化物酶体附近富集从而被共包裹、被液泡特异性识别、或与载体蛋白相互作用后直接运送至液泡。
编译者解读
本研究通过系统的基因缺失策略，将两种胞浆甲醇代谢酶的降解明确归入选择性自噬途径，为甲醇酵母的蛋白质稳态调控提供了新的认识。从合成生物学应用角度看，Fld1和Fdh1的降解机制研究对优化以甲醇为碳源的蛋白生产平台具有直接意义——理解碳源切换时内源蛋白的降解规律，有助于设计更稳定的表达宿主。ATG基因缺失突变体延缓目标蛋白降解的特性，也为外源蛋白的积累提供了潜在的改良方向。不过，Fld1和Fdh1被选择性识别的具体分子机制仍待阐明，后续工作若能鉴定出介导这一过程的受体蛋白，将进一步完善该调控网络。
参考来源
Dmytruk OV, Pelypyshyn UI, Dmytruk KV, Sibirny AA. Autophagic pathway is responsible for selective degradation of cytosolic enzymes formaldehyde and formate dehydrogenases in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii. Sci Rep. PMID: 42225775. DOI: 10.1038/s41598-026-54529-6.
PMID: 42225775