来源：Microb Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
混合连接β-葡聚糖（MLG）是一类结构独特的生物聚合物，其流变学特性使其在食品、医药和材料科学领域展现出广阔的应用前景。然而，其生物合成机制长期以来存在一个关键谜团：负责将聚合物转运出细胞的外膜蛋白究竟是谁？近日，来自西班牙的研究团队在《Microbial Biotechnology》上发表论文，揭示了TolC外膜蛋白是苜蓿中华根瘤菌MLG生物合成中不可或缺的组分，并通过共过表达策略实现了高达约10 g/L的MLG产量，为这一重要生物聚合物的工业化生产铺平了道路。
研究背景
混合连接β-葡聚糖是一类由β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成的葡萄糖聚合物，广泛存在于谷物细胞壁中，具有显著的膳食纤维功能。在微生物领域，根瘤菌合成的MLG因其结构均一、产量可控而备受合成生物学研究者关注。此前研究已阐明，MLG的生物合成受第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）调控，由双顺反子操纵子bgsBA介导。其中，BgsA负责聚合物的合成，BgsB则被认为是膜相关蛋白，参与聚合物的转运或修饰。然而，完整的生物合成机器组成一直未被完全解析——特别是，革兰氏阴性菌外膜上负责将大分子聚合物分泌到胞外的通道蛋白始终缺失。本研究正是瞄准这一空白，试图鉴定MLG生物合成机器中的外膜组分，并在此基础上构建高产菌株。
研究方法
菌株与培养条件：研究涉及的菌株包括苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）、日本中生根瘤菌（Mesorhizobium japonicum）和菜豆根瘤菌（Rhizobium etli）。常规培养采用添加3.40 mM CaCl₂·2H₂O的胰蛋白胨-酵母提取物培养基（TY），或最低培养基（MM）。MM培养基每升含：10 g甘露醇、1.1 g谷氨酸钠、0.3 g KH₂PO₄、0.3 g K₂HPO₄、0.15 g MgSO₄·7H₂O、0.05 g CaCl₂·2H₂O、0.006 g FeCl₃和0.05 g NaCl，并添加1 mL 1000×维生素储备液（含0.2 g/L生物素、0.1 g/L盐酸硫胺素和0.1 g/L泛酸钠）。苜蓿中华根瘤菌和日本中生根瘤菌在28°C培养，菜豆根瘤菌在30°C培养，大肠杆菌用于克隆和接合转移时在37°C LB培养基中培养。抗生素使用浓度：四环素10 μg/mL（菜豆根瘤菌为5 μg/mL）、卡那霉素50 μg/mL、刚果红50 μg/mL、荧光增白剂CF 200 μg/mL、IPTG 1 mM。
三突变体构建：为消除其他c-di-GMP调控的胞外多糖对MLG产量的潜在竞争，研究团队在苜蓿中华根瘤菌8530菌株中构建了缺失EPS II（wgcA基因）、EPS I（exoY基因）和APS（uxs1-uxe基因）的三重突变体IBR606。三个基因的框内缺失依次引入，并通过PCR和表型分析双重验证。
MLG定量：采用地衣多糖酶（lichenase）消化后测定释放的葡萄糖当量。摇瓶培养时，根瘤菌在含100 mL锥形瓶的20 mL液体MM培养基中培养3天，170 rpm振荡，苜蓿中华根瘤菌28°C、菜豆根瘤菌30°C，初始OD₆₀₀调至0.05。
tolC基因功能验证：通过遗传学手段敲除苜蓿中华根瘤菌中的tolC基因，观察MLG合成能力的变化；随后进行回补实验，验证表型恢复。
共过表达模块构建：将tolC、bgsBA和组成型活性二鸟苷酸环化酶基因pleD*共同置于表达质粒中，构建多基因共表达模块。对照质粒不含tolC，用于评估TolC对MLG产量的贡献。
生物反应器发酵：在生物反应器条件下评估最佳菌株的MLG生产能力。
研究结果
TolC是MLG合成的必需组分：遗传学证据清晰表明，tolC基因的破坏完全消除了苜蓿中华根瘤菌的MLG合成能力，而回补tolC则恢复了MLG的产生。这一结果将TolC确立为MLG生物合成机器的核心组件。基于此，研究者提出TolC与BgsA、BgsB形成三组分复合物模型——BgsA负责聚合物链的延伸，BgsB可能作为膜锚定或桥接蛋白，TolC则作为外膜通道，三者协同完成MLG的合成与分泌。这一模型与革兰氏阴性菌中广泛存在的Ⅰ型分泌系统架构高度一致。
三重突变体对MLG产量无显著影响：在生理c-di-GMP水平下，野生型菌株的MLG产量低于检测限；三重突变体IBR606（ΔwgcA ΔexoY Δuxs1-uxe）的MLG产量与野生型相比无显著提升。当引入携带pleD的质粒pJBpleD提高胞内c-di-GMP水平后，IBR606的MLG产量被显著激活，略高于野生型但差异未达统计学显著水平。这一结果表明，EPS I、EPS II和APS的合成能力缺失对MLG产量并无实质性影响，c-di-GMP水平才是MLG合成的决定性因素。
TolC共过表达实现8倍增产：将tolC、bgsBA和pleD共过表达后，MLG产量较不含tolC的对照质粒提升了8倍。这一数据凸显了TolC在MLG分泌途径中的限速作用——仅提高合成能力（bgsBA和pleD）而不增强外排能力，产量提升受限；引入TolC后，合成与分泌通量匹配，产量跃升。在生物反应器条件下，该工程菌株的MLG产量达到约10 g/L。
异源表达实现跨菌株移植：该三基因模块（tolC-bgsBA-pleD*）被导入非产MLG的根瘤菌宿主日本中生根瘤菌后，成功实现了MLG的从头合成。这证明该遗传模块具有出色的可移植性，为更换生产底盘菌株提供了可能。
讨论与展望
这项研究的核心贡献在于鉴定出TolC为MLG生物合成机器的关键外膜组分。此前对MLG合成机制的理解停留在BgsA和BgsB两个膜内组分上，外膜转运环节的缺失使得完整合成通路的构建始终缺一条腿。TolC的发现补全了这一拼图，使得在异源宿主中重建完整的MLG合成-分泌通路成为可能。8倍的产量提升幅度也印证了分泌步骤在MLG生产中的瓶颈地位——这一发现对微生物多糖的代谢工程改造具有普遍参考价值。
从应用角度看，约10 g/L的产量已具备工业化的初步经济性。但值得关注的是，该研究选择的异源宿主日本中生根瘤菌并非典型的工业微生物，其生长速度和遗传操作便利性均不及大肠杆菌或芽孢杆菌。未来若能将这一模块移植至更成熟的工业底盘，配合发酵工艺优化，MLG的产量仍有较大提升空间。此外，TolC-BgsA-BgsB三组分复合物的结构细节尚未解析，明确各组分间的互作界面将有助于理性设计更高效的转运系统。这项研究为MLG的规模化生产提供了坚实平台，也为其他β-葡聚糖类生物聚合物的合成生物学改造提供了可借鉴的范式。
参考来源
Ruiz-Sáez L, Pacheco PJ, Peinado J, Lloret J, Muñoz S. TolC Is Required for a Mixed-Linkage β-Glucan (MLG) Biosynthesis: Engineering Bacteria for MLG Overproduction. Microbial Biotechnology. PMID: 42552791.
PMID: 42552791