来源：Appl Microbiol Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导读
木质纤维素生物质是替代化石资源的重要可再生原料，但其预处理产生的低pH、高温及发酵抑制物等严苛条件对宿主菌提出了极高要求。本研究以具有卓越多胁迫耐受性的非常规酵母东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）为宿主，首次成功建立了功能性蛋白的细胞表面展示系统——基于IoSED1基因的展示模块实现了增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和β-葡萄糖苷酶（BGL）的细胞表面固定化，所得菌株能在纤维二糖为唯一碳源且存在木质纤维素抑制物的条件下稳健生长。
研究背景
气候变化加剧与石油资源枯竭，使可持续生产体系的需求日益迫切。木质纤维素生物质（LCB）——包括稻草、玉米秸秆、木片、甘蔗渣等农业残余物——因储量丰富且不与粮食作物竞争，成为最具潜力的替代原料。LCB主要由纤维素（占总量40–50%）、半纤维素（20–40%）和木质素构成，前两者经化学与酶学处理可水解为可发酵单糖。酵母因抗噬菌体感染、遗传操作便利、异源蛋白表达能力强等优势，是LCB生物转化的重要宿主。然而，多数模式酵母（如酿酒酵母）缺乏天然水解纤维素的能力，且LCB的酸性热化学预处理会产生低pH、高温及糠醛、5-羟甲基糠醛（5-HMF）、香兰素等发酵抑制物。因此，展示纤维素酶的宿主菌株必须具备对这些胁迫的显著耐受性。本研究选用具有突出多胁迫耐受性的东方伊萨酵母，探索在该酵母中建立细胞表面展示系统的可行性。
研究方法
菌株与培养基
大肠杆菌NovaBlue菌株（Novagen，美国威斯康星州）用作重组DNA操作宿主。大肠杆菌转化子在Luria-Bertani培养基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L）中培养，添加100 µg/mL氨苄青霉素，培养温度37 °C。本研究所用东方伊萨酵母野生型菌株共11株，均购自日本NITE生物资源中心（NBRC，东京）；酿酒酵母野生型菌株为BY4741（Life Technologies，美国加利福尼亚州）。所有酵母菌株及转化子的遗传特性汇总于补充表S1。酵母培养使用YPD培养基（酵母提取物10 g/L、Bacto-peptone 20 g/L [Difco Laboratories，美国密歇根州]、葡萄糖20 g/L）、SC-URA dropout培养基（不含氨基酸的酵母氮源6.7 g/L [Difco Laboratories]、不含尿嘧啶的酵母合成dropout补充物1.92 g/L [Sigma-Aldrich，美国密苏里州]、葡萄糖20 g/L）或SD培养基（不含氨基酸的酵母氮源6.7 g/L [Difco Laboratories]、葡萄糖20 g/L）。
东方伊萨酵母NBRC1664的胁迫耐受性分析
为分析低pH和高温耐受性，将东方伊萨酵母和酿酒酵母细胞于3 mL YPD培养基中、30 °C、200 rpm预培养48 h，然后以初始OD600为0.05接种至5 mL SC培养基。SC培养基初始pH分别用1 M HCl调至2、用0.5 M KOH调至6。培养在L形管中进行，使用Bio-photorecorder TVS062CA（ADVANTEC，东京）于30 °C或45 °C、40 rpm条件下培养72 h。为评估对木质纤维素发酵抑制物（糠醛、5-HMF和香兰素）的耐受性，细胞于3 mL YPD培养基中、30 °C、200 rpm预培养24 h。用Milli-Q水制备系列稀释液（OD600分别为1、0.1、0.01、0.001），各取3 µL点样于补充了尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸及一种抑制物（糠醛21 mM；5-HMF 28 mM；香兰素10 mM）的SD琼脂平板。平板于30 °C培养96–120 h，菌落生长情况用凝胶成像系统FAS-X（Nippon Genetics，东京）记录。
东方伊萨酵母NBRC1664尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建
使用Kaneka Easy DNA Extraction Kit version 2（Kaneka，大阪）提取东方伊萨酵母NBRC1664基因组DNA。以URA3-UP-F/URA3-UP-R引物和URA3-DOWN-F/URA3-DOWN-R引物（Xiao等，2014）分别PCR扩增东方伊萨酵母URA3（IoURA3）开放阅读框（ORF）的上游（543 bp）和下游（279 bp）同源臂。通过重叠延伸PCR融合上述片段，将所得DNA片段导入NBRC1664。转化子在补充1 mg/mL 5-氟乳清酸（5-FOA）的SC琼脂平板上筛选。用Colony-P-F和Colony-P-R引物通过菌落PCR确认IoURA3 ORF的删除。为验证尿嘧啶营养缺陷，将转化子划线于含或不含尿嘧啶（76 µg/mL）的SD琼脂平板，30 °C培养。
细胞表面展示模块的构建
所有质粒均使用In-Fusion试剂盒（TaKaRa Bio，滋贺）按制造商说明书构建。所用质粒和引物分别汇总于补充表S2和S3。
以URA3-F和Colony-P-R引物从东方伊萨酵母NBRC1664基因组DNA PCR扩增IoURA3基因片段。将扩增片段导入酵母着丝粒穿梭载体pRS415的HindIII位点，得到质粒pVT。以ScSED1p-F和ScSAG1t-R引物从质粒pleGFP-SSS（Inokuma等，2020）PCR扩增含增强型绿色荧光蛋白（eGFP）细胞表面展示基因表达模块，导入pVT的SacI位点，得到质粒pVT-SceGFP。
以IoSED1a-F1和IoSED1a-R1引物从东方伊萨酵母NBRC1664基因组DNA PCR扩增IoSED1编码区（去除其分泌信号，表S4）。将扩增片段与以Vector-F/Vector-R引物、plBG-SSS（Inokuma等，2016）为模板PCR产生的DNA片段融合。所得质粒命名为plBG-SSIoS，其中plBG-SSS的锚定域被替换为IoSED1锚定域。构建含IoSED1启动子、分泌信号和锚定域的eGFP展示质粒步骤如下：以IoSED1ps-F1和IoSED1ps-R1引物从东方伊萨酵母NBRC10737基因组DNA PCR扩增含IoSED1启动子和分泌信号的DNA片段；以eGFP-F和eGFP-R引物从pleGFP-SSS PCR扩增eGFP编码区；以IoSED1a-F2和IoSED1a-R2引物从plBG-SSIoS PCR扩增IoSED1锚定域编码片段。将上述三个片段导入pVT的SacI位点，生成质粒pVT-IoeGFP。
用于将基因导入东方伊萨酵母NBRC1664染色体2先前鉴定的基因间位点IS2（Lee等，2022）的整合型质粒构建如下：以IS2-UP-F/IS2-UP-R引物和IS2-DOWN-F/IS2-DOWN-R引物分别从东方伊萨酵母NBRC1664基因组DNA扩增IS2上游和下游约1 kbp的DNA片段。在IS2-UP-R的重叠区插入PacI识别位点。通过重叠延伸PCR融合上述两个片段，获得中心含一个PacI位点的DNA片段。将该片段导入pVT的PpuMI位点，所得质粒命名为pVT-IS。以IoSED1p-F和ScSAG1t-R引物从pVT-IoeGFP PCR扩增eGFP展示基因表达模块，导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-IoeGFP。
用于展示棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）BGL1的整合型质粒构建如下：以IoSED1ps-F1/IoSED1ps-R2引物和IoSED1a-F2/IoSED1a-R2引物分别从pVT-IoeGFP扩增IoSED1启动子与分泌信号片段和IoSED1锚定域片段。以BGL-F和BGL-R引物从plBG-SSS PCR扩增编码棘孢曲霉BGL1的DNA片段。将上述三个片段导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-BGL。
细胞表面展示菌株的构建
为构建展示eGFP的东方伊萨酵母菌株，将携带eGFP展示模块的游离型质粒pVT-SceGFP或pVT-IoeGFP导入NBRC1664/ura3Δ菌株，分别得到16-ScGFP-p和16-IoGFP-p菌株。空载体pVT以同样方式导入NBRC1664/ura3Δ菌株，得到16-pVT菌株。为实现eGFP展示模块的基因组整合，用PacI线性化整合型质粒pVT-IS-IoeGFP并整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，得到16-IoGFP-int菌株。类似地，为构建展示BGL的东方伊萨酵母菌株，用PacI线性化整合型质粒pVT-IS-IoBGL并整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，得到16-IoBG-int菌株。
所有东方伊萨酵母菌株均采用醋酸锂法转化，方法参照Xiao等（2014）并作少量修改。酵母细胞于3 mL YPD培养基中、30 °C、200 rpm过夜培养。取适量接种至3 mL新鲜YPD培养基中继续培养。
研究结果
东方伊萨酵母NBRC1664的多胁迫耐受性评估
为比较东方伊萨酵母与模式酵母酿酒酵母的多胁迫耐受性，研究人员评估了从NBRC获得的11株东方伊萨酵母中耐受性最强的NBRC1664（图S1）与酿酒酵母BY4741在低pH、高温和木质纤维素发酵抑制物条件下的胁迫耐受性。如图1a所示，两种菌在pH 6时均生长良好，但东方伊萨酵母的生长优于酿酒酵母。东方伊萨酵母在pH 2时表现出稳健生长，72 h后的OD600与pH 6条件下几乎相同；而酿酒酵母在pH 2时完全无法生长。类似地，在45 °C条件下东方伊萨酵母成功生长而酿酒酵母不能；两种菌在正常温度30 °C下均生长良好（图1b）。进一步地，为评估在发酵抑制物（21 mM糠醛、28 mM 5-HMF和10 mM香兰素）存在下的生长情况，进行了点板实验（图1c）。本研究所用各抑制物浓度处于木质纤维素水解液中观察到的范围内（Mills等，2009）。在补充适宜营养物的SD培养基非胁迫条件下，两种菌均形成明显菌落。当暴露于发酵抑制物时，东方伊萨酵母在全部三种抑制物条件下均成功形成清晰菌落，而酿酒酵母在任何抑制物条件下均无法生长。上述结果与Akita和Matsushika（2024）的报道一致。综合来看，东方伊萨酵母NBRC1664具有卓越的多胁迫耐受性。
展示eGFP的东方伊萨酵母菌株评估
为确定与GPI锚定域融合的蛋白能否固定在东方伊萨酵母细胞表面，研究人员构建了eGFP展示基因表达模块，并通过荧光显微镜检查eGFP信号的定位。首先尝试表达此前已证实能在酿酒酵母细胞表面展示eGFP的基因表达模块（Inokuma等，2020），该模块由酿酒酵母SED1（ScSED1）启动子、分泌信号和锚定域以及酿酒酵母SAG1终止子组成（图2a）。将携带该模块的游离型质粒pVT-SceGFP导入东方伊萨酵母NBRC1664/ura3Δ菌株——其尿嘧啶营养缺陷已通过生长分析确认（图S2）——并按“材料与方法”所述进行荧光显微镜观察。然而，未检测到eGFP信号（图2b）。
研究人员随后假设荧光缺失源于模块中异源遗传元件在东方伊萨酵母中功能不佳。细胞表面展示模块的启动子、分泌信号和锚定域对展示效率有决定性影响（Inokuma等，2014，2016；Zhang等，2013）。因此，构建了一个改良展示模块，将上述各元件分别替换为IoSED1基因的对应元件（图2a）——IoSED1与ScSED1基因同源（Kitagawa等，2010），且根据big-PI Fungal Predictor等预测工具（Eisenhaber等，2004）预测编码GPI锚定蛋白。此外，IoSED1来源的信号序列已被报道能介导目标蛋白的胞外分泌（Kitagawa等，2010）。将新构建的展示模块导入NBRC1664/ura3Δ后，荧光显微镜观察揭示了清晰的表面定位荧光（图2b）。荧光模式与酿酒酵母eGFP展示菌株（Inokuma等，2020）中观察到的相当，表明eGFP成功展示在东方伊萨酵母细胞表面。
尽管检测到表面定位的eGFP信号，但仅有限数量的细胞呈现荧光。为提高展示eGFP的细胞比例，将展示模块整合至基因组。按“材料与方法”所述构建了设计用于将模块插入东方伊萨酵母NBRC1664 IS2位点（Lee等，2022）的整合型质粒，并将eGFP展示模块整合至NBRC1664/ura3Δ菌株。与携带质粒的菌株（16-IoGFP-p）相比，基因组整合菌株（16-IoGFP-int）的荧光显微镜观察显示，呈现清晰表面定位信号的细胞比例大幅提高（图2b），这与流式细胞术结果（图S3）一致。综上，上述结果证明成功构建了能够在东方伊萨酵母细胞表面展示目标蛋白的基因表达模块。
展示β-葡萄糖苷酶的东方伊萨酵母菌株评估
接下来，利用所构建的蛋白细胞表面展示基因表达模块，构建了展示棘孢曲霉BGL1的东方伊萨酵母菌株——BGL1可将纤维二糖水解为葡萄糖（Murao等，1988），所得菌株命名为16-IoBG-int（图3a）。该菌株于YPD培养基中30 °C培养72 h，随后在30 °C下评估细胞部分和培养上清液中的BGL活性。16-IoBG-int及其亲本菌株的培养上清液中均未检测到BGL活性。相比之下，16-IoBG-int的细胞部分表现出显著更高的BGL活性（4.35 ± 0.5 mU/OD600），而亲本菌株的细胞部分几乎检测不到活性（图3b）。这表明BGL已成功展示在东方伊萨酵母细胞表面。
此外，为评估所展示的棘孢曲霉BGL1在LCB生物转化预期高温条件下的活性（Yanase等，2010），将在30 °C培养72 h的细胞于45 °C进行相同BGL活性测定。在45 °C条件下，BGL活性显著升高至30 °C测定值的3倍以上（16.1 ± 1.6 mU/OD600）（图3c）。该结果与棘孢曲霉BGL1最适温度处于50 °C以上高温范围的事实一致（Murao等，1988）。
胁迫条件下以纤维二糖为唯一碳源的发酵实验
为评估所构建的BGL展示菌株能否在胁迫条件下以纤维二糖为唯一碳源生长，进行了以下发酵实验。
讨论与解读
本研究开发了适用于多胁迫耐受酵母东方伊萨酵母的细胞表面展示模块，并成功构建了在其细胞表面展示棘孢曲霉BGL1的菌株。该菌株能以纤维二糖为唯一碳源稳健生长，且在LCB生物转化相关的多种胁迫条件下仍能同化纤维二糖，表明携带纤维素酶的东方伊萨酵母菌株非常适合高效的LCB生物转化。
通过采用源自IoSED1基因的启动子、分泌信号和锚定域，研究成功展示了eGFP。基因组整合展示模块后，呈现细胞表面eGFP荧光的细胞比例较游离型质粒表达系统大幅提高，表明质粒表达在东方伊萨酵母NBRC1664中本质上不稳定。该解释与此前报道一致——携带相同酿酒酵母来源着丝粒和自主复制序列的游离型质粒在另一株东方伊萨酵母中表现出不稳定性（Tran等，2019；Cao等，2020）。另一方面，即使在基因组整合菌株中，仍能观察到一部分无荧光细胞。值得注意的是，较小尺寸的细胞几乎不显示荧光。
编译者解读
本研究的意义在于将成熟的酿酒酵母表面展示技术成功移植至非模式工业酵母东方伊萨酵母——这一策略直击木质纤维素生物转化的痛点：预处理产生的复合胁迫环境使多数工程菌株难以存活。作者从同源基因IoSED1出发重新设计展示模块而非简单照搬酿酒酵母元件，体现了合成生物学中“宿主适配”的核心理念。基因组整合优于游离质粒的发现也为后续工业菌株开发提供了重要参考。值得关注的是，BGL展示菌株在45 °C下酶活较30 °C提升3倍以上，这一特性与同步糖化发酵工艺的高温需求天然契合。不过，部分细胞仍不显示荧光的问题提示该展示系统尚存异质性，其分子机制有待进一步阐明。
参考来源
Kawahara Y, Nasuno R, Jin YS, Hasunuma T. Engineering a robust cell-surface display platform in the multi-stress-tolerant yeast Issatchenkia orientalis. Appl Microbiol Biotechnol. PMID: 42154235.
PMID: 42154235