来源：Appl Microbiol Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导读
木质纤维素生物质是极具潜力的可再生资源，但其生物转化常面临低pH、高温及发酵抑制物等多重胁迫。本研究以具有卓越多胁迫耐受性的非常规酵母东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）为宿主，发现基于酿酒酵母的展示组件在该酵母中失效后，成功构建了基于内源 IoSED1 基因启动子、分泌信号及锚定域的展示载体。研究实现了增强型绿色荧光蛋白（eGFP）与β-葡萄糖苷酶（BGL）在细胞表面的功能展示，所得菌株能以纤维二糖为唯一碳源稳健生长，且在发酵抑制物存在下仍保持生长。该工作首次报道了在 I. orientalis 细胞表面固定功能蛋白并同化木质纤维素来源中间产物的成功案例。
研究背景
气候变化与石油资源枯竭正加速推动可持续生物制造体系的发展。木质纤维素生物质（LCB）因储量丰富且不与粮争地，被视为化石原料的重要替代。LCB 中纤维素与半纤维素分别占总量 40–50% 与 20–40%，可水解为可发酵单糖，进而经工程微生物转化为生物基化学品与燃料。酵母因抗噬菌体、遗传操作便利及异源蛋白表达能力强等优势成为理想宿主。然而，多数模式酵母（如酿酒酵母）缺乏天然水解纤维素与半纤维素的能力，且 LCB 的酸性热化学预处理会形成低pH、高温及含抑制物的严苛培养环境，对展示纤维素酶的宿主菌提出了极高耐受性要求。本研究选用多胁迫耐受性突出的 I. orientalis 为宿主，旨在建立适用于该菌的细胞表面展示平台。
研究方法
菌株与培养基
大肠杆菌 NovaBlue 菌株（Novagen，美国威斯康星州）用作重组 DNA 操作宿主。大肠杆菌转化子在 Luria-Bertani 培养基（10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、5 g/L 氯化钠）中培养，添加 100 µg/mL 氨苄青霉素，培养温度为 37 °C。本研究所用 I. orientalis 野生型菌株共 11 株，均购自日本 NITE 生物资源中心（NBRC，东京）；酿酒酵母野生型菌株为 BY4741（Life Technologies，美国加利福尼亚州）。所用酵母菌株及转化子的遗传特性汇总于补充表 S1。酵母培养所用培养基为 YPD（10 g/L 酵母提取物、20 g/L Bacto-peptone [Difco Laboratories，美国密歇根州]、20 g/L 葡萄糖）、缺乏尿嘧啶的合成完全（SC-URA） dropout 培养基（6.7 g/L 酵母氮碱基无氨基酸 [Difco Laboratories]、1.92 g/L 酵母合成 dropout 培养基补充物无尿嘧啶 [Sigma-Aldrich，美国密苏里州]、20 g/L 葡萄糖）或合成葡萄糖（SD）培养基（6.7 g/L 酵母氮碱基无氨基酸 [Difco Laboratories]、20 g/L 葡萄糖）。
I. orientalis NBRC1664 的胁迫耐受性分析
为分析低pH与高温耐受性，将 I. orientalis 与 S. cerevisiae 细胞在 3 mL YPD 培养基中于 30 °C、200 rpm 预培养 48 h，然后以初始 OD600 为 0.05 接种至 5 mL SC 培养基。SC 培养基初始 pH 分别用 1 M HCl 调至 2 或 0.5 M KOH 调至 6。培养在 L 形管中进行，使用 Bio-photorecorder TVS062CA（ADVANTEC，东京）于 30 °C 或 45 °C、40 rpm 条件下培养 72 h。为评估对木质纤维素发酵抑制物（糠醛、5-HMF 和香兰素）的耐受性，将细胞在 3 mL YPD 培养基中于 30 °C、200 rpm 预培养 24 h。用 Milli-Q 水制备系列稀释液（OD600 为 1、0.1、0.01 或 0.001），取各稀释液 3 µL 点样于补充了尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸及一种抑制物（糠醛 21 mM；5-HMF 28 mM；香兰素 10 mM）的 SD 琼脂平板。平板于 30 °C 培养 96–120 h，使用凝胶成像系统 FAS-X（Nippon Genetics，东京）记录菌落生长。
I. orientalis NBRC1664 尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建
使用 Kaneka Easy DNA Extraction Kit version 2（Kaneka，大阪）提取 I. orientalis NBRC1664 基因组 DNA。I. orientalis URA3（IoURA3）开放阅读框（ORF）上游（543 bp）与下游（279 bp）同源臂分别以 URA3-UP-F/URA3-UP-R 引物和 URA3-DOWN-F/URA3-DOWN-R 引物经聚合酶链式反应（PCR）扩增（Xiao et al. 2014）。两片段经重叠延伸 PCR 融合，所得 DNA 片段导入 NBRC1664。转化子在补充 1 mg/mL 5-氟乳清酸（5-FOA）的 SC 琼脂平板上筛选。IoURA3 ORF 的缺失经菌落 PCR 以 Colony-P-F 和 Colony-P-R 引物确认。为验证尿嘧啶营养缺陷，转化子划线于含或不含尿嘧啶（76 µg/mL）的 SD 琼脂平板，30 °C 培养。
细胞表面展示载体的构建
所有质粒均使用 In-Fusion 试剂盒（TaKaRa Bio，滋贺）按制造商说明构建。所用质粒与引物分别汇总于补充表 S2 和 S3。IoURA3 基因 DNA 片段以 URA3-F 和 Colony-P-R 引物从 I. orientalis NBRC1664 基因组 DNA 经 PCR 扩增，导入酵母着丝粒穿梭载体 pRS415 的 HindIII 位点，获得 pVT。含增强型绿色荧光蛋白（eGFP）细胞表面展示基因表达盒的质粒 pleGFP-SSS（Inokuma et al. 2020）以 ScSED1p-F 和 ScSAG1t-R 引物经 PCR 扩增，导入 pVT 的 SacI 位点，获得 pVT-SceGFP。
IoSED1 编码区除分泌信号外的部分（表 S4）以 IoSED1a-F1 和 IoSED1a-R1 引物从 I. orientalis NBRC1664 基因组 DNA 经 PCR 扩增。所得片段与以 Vector-F 和 Vector-R 引物、以质粒 plBG-SSS（Inokuma et al. 2016）为模板经 PCR 生成的 DNA 片段融合，所得质粒命名为 plBG-SSIoS，其中 plBG-SSS 的锚定域被替换为 IoSED1 锚定域。用于以 IoSED1 启动子、分泌信号和锚定域展示 eGFP 的质粒构建如下：含 IoSED1 启动子和分泌信号的 DNA 片段以 IoSED1ps-F1 和 IoSED1ps-R1 引物从 I. orientalis NBRC10737 基因组 DNA 经 PCR 扩增；eGFP 编码区 DNA 片段以 eGFP-F 和 eGFP-R 引物从 pleGFP-SSS 经 PCR 扩增；编码 IoSED1 锚定域的 DNA 片段以 IoSED1a-F2 和 IoSED1a-R2 引物从 plBG-SSIoS 经 PCR 扩增。三个片段导入 pVT 的 SacI 位点，生成质粒 pVT-IoeGFP。
用于将基因导入 I. orientalis NBRC1664 染色体 2 上先前鉴定的基因间位点 IS2（Lee et al. 2022）的整合型质粒构建如下：IS2 上游与下游约 1 kbp 的 DNA 片段分别以 IS2-UP-F/IS2-UP-R 引物和 IS2-DOWN-F/IS2-DOWN-R 引物从 I. orientalis NBRC1664 基因组 DNA 扩增。在 IS2-UP-R 的重叠区插入 PacI 识别位点。两片段经重叠延伸 PCR 融合，获得中心含一个 PacI 位点的 DNA 片段。该片段导入 pVT 的 PpuMI 位点，所得质粒命名为 pVT-IS。pVT-IoeGFP 中展示 eGFP 的基因表达盒以 IoSED1p-F 和 ScSAG1t-R 引物经 PCR 扩增，所得片段导入 pVT-IS 的 SacI 位点，所得质粒命名为 pVT-IS-IoeGFP。
用于展示 A. aculeatus BGL1 的整合型质粒构建如下：IoSED1 启动子和分泌信号及 IoSED1 锚定域的 DNA 片段分别以 IoSED1ps-F1/IoSED1ps-R2 引物和 IoSED1a-F2/IoSED1a-R2 引物从 pVT-IoeGFP 扩增。编码 A. aculeatus BGL1 的 DNA 片段以 BGL-F 和 BGL-R 引物从 plBG-SSS 经 PCR 扩增。三个片段导入 pVT-IS 的 SacI 位点，所得质粒命名为 pVT-IS-BGL。
细胞表面展示菌株的构建
为构建展示 eGFP 的 I. orientalis 菌株，将携带 eGFP 展示盒的游离型质粒 pVT-SceGFP 或 pVT-IoeGFP 导入 NBRC1664/ura3Δ 菌株，分别获得 16-ScGFP-p 和 16-IoGFP-p 菌株。空载体 pVT 同样导入 NBRC1664/ura3Δ 菌株，获得 16-pVT 菌株。对于 eGFP 展示盒的基因组整合，整合型质粒 pVT-IS-IoeGFP 经 PacI 线性化后整合至 NBRC1664/ura3Δ 菌株的 IS2 位点，获得 16-IoGFP-int 菌株。类似地，为构建展示 BGL 的 I. orientalis 菌株，整合型质粒 pVT-IS-IoBGL 经 PacI 线性化后整合至 NBRC1664/ura3Δ 菌株的 IS2 位点，获得 16-IoBG-int 菌株。
所有 I. orientalis 菌株均采用乙酸锂法转化，方法参照先前报道（Xiao et al. 2014）并略作修改。酵母细胞在 3 mL YPD 培养基中于 30 °C、200 rpm 过夜培养，取适量接种至 3 mL 新鲜 YPD 培养基中（原文此处未详述后续步骤）。
研究结果
I. orientalis NBRC1664 的多胁迫耐受性评估
为比较 I. orientalis 与模式酵母 S. cerevisiae 的多胁迫耐受性，我们评估了 I. orientalis NBRC1664（从 NBRC 获得的 11 株 I. orientalis 菌株中耐受性最强的一株，图 S1）与 S. cerevisiae BY4741 在低pH、高温及木质纤维素发酵抑制物条件下的胁迫耐受性。如图 1a 所示，两种菌在 pH 6 下均生长良好，但 I. orientalis 的生长优于 S. cerevisiae。I. orientalis 在 pH 2 下表现出稳健生长，72 h 后 OD600 与 pH 6 条件下几乎相同；而 S. cerevisiae 在 pH 2 下无法生长。类似地，I. orientalis 在 45 °C 下成功生长而 S. cerevisiae 不能；两种菌在正常温度 30 °C 下均生长良好（图 1b）。此外，为评估在发酵抑制物（21 mM 糠醛、28 mM 5-HMF 和 10 mM 香兰素）存在下的生长情况，进行了点样实验（图 1c）。本研究所用各抑制物浓度处于木质纤维素水解液中观察到的范围内（Mills et al. 2009）。在补充了适宜营养物的 SD 培养基上，两种菌在非胁迫条件下均形成明显菌落。当暴露于发酵抑制物时，I. orientalis 在三种抑制物条件下均成功形成清晰菌落，而 S. cerevisiae 在任何抑制物条件下均无法生长。这些结果与 Akita 和 Matsushika（2024）的报道一致。综上，I. orientalis NBRC1664 具有卓越的多胁迫耐受性。
展示 eGFP 的 I. orientalis 菌株评估
为确定与 GPI 锚定域融合的蛋白能否固定在 I. orientalis 细胞表面，我们构建了 eGFP 展示基因表达盒，并通过荧光显微镜检查 eGFP 信号的定位。首先，尝试表达先前在 S. cerevisiae 细胞表面展示 eGFP 的基因表达盒（Inokuma et al. 2020），该表达盒由 S. cerevisiae SED1（ScSED1）启动子、分泌信号和锚定域及 S. cerevisiae SAG1 终止子组成（图 2a）。携带该表达盒的游离型质粒 pVT-SceGFP 导入 I. orientalis NBRC1664/ura3Δ 菌株（尿嘧啶营养缺陷型，其尿嘧啶缺陷经生长分析确认，图 S2），按“材料与方法”所述进行荧光显微镜观察。然而，未检测到 eGFP 信号（图 2b）。
接下来，我们假设荧光缺失源于异源遗传元件在该表达盒于 I. orientalis 中功能不佳。细胞表面展示表达盒的启动子、分泌信号和锚定域对展示效率有决定性影响（Inokuma et al. 2014, 2016; Zhang et al. 2013）。因此，我们构建了修饰型展示表达盒，将上述各元件替换为 IoSED1 基因的对应元件（图 2a）。IoSED1 与 ScSED1 基因同源（Kitagawa et al. 2010），且基于 big-PI Fungal Predictor（Eisenhaber et al. 2004）等预测工具被预测编码 GPI 锚定蛋白。此外，IoSED1 基因来源的信号序列已被报道可介导目标蛋白的胞外分泌（Kitagawa et al. 2010）。将新构建的展示表达盒导入 NBRC1664/ura3Δ 后，荧光显微镜观察显示清晰的表面定位荧光（图 2b）。荧光模式与展示 eGFP 的 S. cerevisiae 菌株（Inokuma et al. 2020）中观察到的相当，表明 eGFP 成功展示在 I. orientalis 细胞表面。
尽管检测到表面定位的 eGFP 信号，但仅有限数量的细胞观察到荧光。为提高展示 eGFP 的细胞比例，我们将展示表达盒整合至基因组。按“材料与方法”所述构建了设计用于将表达盒插入 I. orientalis NBRC1664 IS2 位点的整合型质粒（Lee et al. 2022），并将 eGFP 展示表达盒整合至 NBRC1664/ura3Δ 菌株。与携带质粒的菌株（16-IoGFP-p）相比，基因组整合菌株（16-IoGFP-int）的荧光显微镜观察显示，呈现清晰表面定位信号的细胞比例大幅增加（图 2b），这与流式细胞术结果一致（图 S3）。综上，这些结果证明成功构建了能够在 I. orientalis 细胞表面展示目标蛋白的基因表达盒。
展示β-葡萄糖苷酶的 I. orientalis 菌株评估
接下来，利用所构建的蛋白细胞表面展示基因表达盒，我们构建了展示 A. aculeatus BGL1 的 I. orientalis 菌株，BGL1 可将纤维二糖水解为葡萄糖（Murao et al. 1988），所得菌株命名为 16-IoBG-int（图 3a）。该菌株在 YPD 培养基中于 30 °C 培养 72 h，随后在 30 °C 下评估细胞组分与培养上清中的 BGL 活性。16-IoBG-int 及其亲本菌株的培养上清中均未检测到 BGL 活性。相比之下，16-IoBG-int 的细胞组分表现出显著更高的 BGL 活性（4.35 ± 0.5 mU/OD600），而亲本菌株的细胞组分几乎检测不到活性（图 3b）。这表明 BGL 已成功展示在 I. orientalis 细胞表面。
此外，为评估所展示的 A. aculeatus BGL1 在 LCB 生物转化预期高温条件下的活性（Yanase et al. 2010），将 30 °C 培养 72 h 的细胞在 45 °C 下进行相同的 BGL 活性测定。在 45 °C 下测定时，BGL 活性显著升高至 30 °C 测定值的 3 倍以上（16.1 ± 1.6 mU/OD600）（图 3c）。该结果与 A. aculeatus BGL1 最适温度位于 50 °C 以上高温范围的事实一致（Murao et al. 1988）。
胁迫条件下以纤维二糖为唯一碳源的发酵
为评估所构建的 BGL 展示菌株是否能以纤维二糖为唯一碳源生长，将 16-IoBG-int 菌株接种于含 1.9% 纤维二糖和 0.1 M MOPS（pH 6.5）的 SC 培养基中培养。16-IoBG-int 菌株表现出稳健生长，而亲本菌株 NBRC1664/ura3Δ 几乎不生长（图 4a）。培养过程中，16-IoBG-int 菌株培养基中残留纤维二糖浓度随细胞生长同步下降（图 4b），表明纤维二糖被有效水解并同化。
进一步在含 25.4 mM 5-HMF（图 4c）或 100 mM 乙酸（图 4d）的相同培养基中评估 16-IoBG-int 的生长。结果显示，在存在这些木质纤维素发酵抑制物的情况下，16-IoBG-int 菌株仍能维持生长，表明该菌株在胁迫条件下仍具备纤维二糖同化能力。
讨论与解读
本研究开发了适用于多胁迫耐受酵母 I. orientalis 的细胞表面展示表达盒。利用该表达盒，成功构建了在细胞表面展示 A. aculeatus BGL1 的菌株，该菌株能以纤维二糖为唯一碳源稳健生长，并能在多种与 LCB 生物转化相关的胁迫条件下同化纤维二糖。通过采用 IoSED1 基因来源的启动子、分泌信号和锚定域构建新表达盒，实现了 eGFP 的成功展示。研究发现基因组整合表达盒相比游离型质粒表达系统可显著提高细胞表面呈现 eGFP 荧光的细胞比例，提示游离型质粒表达在 I. orientalis NBRC1664 中本质上不稳定。这一解释与先前报道一致，即携带相同酿酒酵母来源着丝粒和自主复制序列的游离型质粒在另一 I. orientalis 菌株中也表现出不稳定性（Tran et al. 2019; Cao et al. 2020）。另一方面，即使在基因组整合菌株中，仍观察到部分无荧光细胞。值得注意的是，如图 2b 所示，较小尺寸的细胞几乎不显示荧光。
编译者解读
该研究的关键价值在于揭示了异源展示元件在非模式酵母中的"水土不服"问题，并以宿主内源 SED1 基因元件替代加以解决——这一策略对其它非常规酵母的细胞表面工程具有直接借鉴意义。基因组整合优于游离型质粒的发现也提示，在 I. orientalis 中开展长期发酵应用时，染色体整合是更稳妥的基因表达方式。BGL 展示菌株在 5-HMF 和乙酸存在下仍能以纤维二糖为碳源生长，为"一步式"纤维素乙醇或生物基化学品生产提供了有潜力的候选菌株。不过，目前展示系统在真实预处理水解液中的长期运行稳定性及多种纤维素酶共展示的协同效果，仍有待后续验证。
参考来源
Kawahara Y, Nasuno R, Jin YS, Hasunuma T. Engineering a robust cell-surface display platform in the multi-stress-tolerant yeast Issatchenkia orientalis. Appl Microbiol Biotechnol. PMID: 42154235.
PMID: 42154235