来源：Bioprocess Biosyst Eng | 编译：DNA Lab Space
导读
纤维素酶的原位生产是提升二代乙醇生物炼制经济性与可持续性的关键路径，但固态发酵（SSF）中的传热限制、反应器操作和下游处理瓶颈长期制约其工业化进程。本研究以甘蔗渣与麦麸（7:3 w/w）为底物，在多层填充床生物反应器中系统评估了嗜热真菌嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila I-1D3b）在批式和连续两种操作模式下的内切葡聚糖酶生产、提取、回收与稳定化全流程。连续操作在保持平均酶活（96.36 ± 4.63 U·g.d.s⁻¹）的同时显著降低了模块间差异，硫酸铵沉淀回收率达78.7%，酶活达156 U·g.d.s⁻¹。
研究背景
循环生物经济被视为有机副产物可持续增值的重要策略，通过将其转化为能源、生物材料和附加值生物产品实现资源效率提升。木质纤维素生物炼制厂作为关键平台，整合了生物技术与物理化学转化路线。二代乙醇的可行性高度依赖高效的纤维素酶系用于木质纤维素生物质糖化。原位纤维素酶生产是降低对外购商品酶制剂依赖、增强生物炼制厂酶自给能力的战略替代方案。固态发酵因能直接利用农工副产物为底物、较液体深层发酵需水量低、契合循环生物经济原则而备受关注。在固态发酵反应器构型中，填充床系统因设计简单、传质效率较高而具有吸引力，但热量积聚与床层不均匀性仍是其放大应用的核心障碍。
研究方法
微生物与底物
产纤维素酶微生物为嗜热真菌 Myceliophthora thermophila I-1D3b。该菌株最初分离自巴西Olímpia的Usina Guarani甘蔗渣堆，因在摇瓶和生物反应器规模的纤维素酶生产中表现优异而被选用。
种子制备：菌株在含60 mL Sabouraud Dextrose Agar（SDA）培养基的锥形瓶中斜面培养，置于生化需氧量培养箱（BOD，型号SL 200，Solab，巴西）中45 °C培养至少48 h以促进菌丝生长和产孢。培养结束后，用100 mL无菌营养液轻轻刮取琼脂表面收集孢子。该营养液pH调至5.0，组成如下（w/v）：0.35%（NH₄）₂SO₄、0.30% KH₂PO₄、0.05% MgSO₄·7H₂O、0.05% CaCl₂和0.10% Tween 20。孢子悬浮液标准化至每克干固体（g.d.s）1 × 10⁷个孢子。
固体底物选用甘蔗渣（SCB）和麦麸（WB），因其成本低、区域供应充足，且能为固体基质提供有利的营养和结构条件。SCB由巴西Usina Ipiranga Agroindustrial S.A.提供，WB购自当地供应商（Agropecuária Claro，São Carlos，SP，巴西）。SCB先在鼓风干燥箱（型号035，Marconi，巴西）中60 °C干燥至含水量10–15%，含水量用水分分析仪（M5 Thermo，Bel Engineering，Monza，意大利）测定。干燥后过筛，筛孔尺寸为5 × 5 mm和4 × 2 mm。麦麸直接使用，含水量12%（湿基），平均粒径最大1.8 mm。
填充床生物反应器中的固态发酵
固态发酵实验在填充床生物反应器（PBB）中进行。该系统由不锈钢制成，由底部带孔的圆柱形模块组成，模块长10 cm，内径13 cm，外径15 cm。每个模块的环形空间作为水夹套，实现床层温度控制并缓解填充床SSF中常见的过热现象。
过程空气由压缩机供给，依次通过针阀、生物过滤器和AppliTech®流量计（Asa，意大利），然后进入填充玻璃珠的夹套柱。玻璃珠间的空隙填充维持在操作温度的蒸馏水，以在空气进入反应器前促进空气饱和——这是减少SSF过程中床层过度干燥的推荐策略。反应器出口处，渗透气体通过除湿系统，该系统由连接接收瓶的冷凝液收集器和直径5.2 cm、高39 cm的硅胶柱组成。该装置将出口空气的相对湿度降至15%以下，这是使用Vaisala Carbocap探头（Vantaa，芬兰）正确测量CO₂浓度所必需的条件。
反应器垂直放置，包含入口模块（IL）和出口模块（OL），两者均带夹套，外部尺寸与中间发酵模块相同，但内部为锥形几何结构。操作时空气自下而上流过固定床。入口模块（IL）位于系统底部，填充玻璃珠以促进气流均匀分布；出口模块（OL）留空以利于气体流动。此外，两个辅助模块分别填充湿粗甘蔗渣（IAL）和干粗甘蔗渣（OAL），用于减少发酵模块过度失水并吸收出口模块壁面凝结的水分。每个辅助模块填充90 g粗SCB。
操作温度维持在45 °C——该温度已被报道为 M. thermophila 产内切葡聚糖酶的最适温度。发酵时间96 h。实验期间，过程空气和循环水均通过模块和加湿器夹套中的水循环维持在45 °C，由恒温水浴（型号SL-152，Solar，巴西）供给，渗透空气流量固定为250 L h⁻¹以增强氧传质并维持整个床层适宜的湿度条件。
发酵温度曲线通过安装在每个发酵模块进出口法兰上的T型热电偶随时间监测。传感器尖端位于每个模块的径向中心，可监测整个发酵过程中床层内部温度的演变。信号由National Instruments COMPAQ-DAQ数据采集系统记录，运行基于LabVIEW软件（National Instruments，Austin，USA）开发的自编程序。
在模块的添加、移除和重新定位过程中，固体底物会暂时暴露于实验室环境。但所有操作均在无菌条件下进行以最大程度减少微生物污染。底物和营养液在121 °C高压灭菌20 min，分开灭菌。冷却后在经紫外辐射灭菌的超净工作台中将各组分与孢子悬浮液混合均匀。空气过滤器和加湿装置在每次发酵前也经过灭菌。
发酵培养基由SCB和WB以7:3（w/w）比例混合制备。含水量通过添加营养液和接种物悬浮液调整至75%（湿基），接种量足以提供每克干固体1 × 10⁷个孢子。每个发酵模块填充130 g干底物。
操作模式
为评价操作模式（批式和连续）对生物过程性能的影响，在两种构型下进行发酵，连续操作分为上行和下行两种模式。批式培养中，PBB在发酵开始时组装所有发酵模块，并保持相同构型直至96 h终点。该条件作为与连续模式实验比较的参考。4天发酵使用4个发酵模块，分别标记为L1、L2、L3和L4。
连续模式下，模块每24 h单独添加，通过接种、装填和耦合到PBB的序列步骤完成。初始阶段床层高度逐渐增加，直至第一个插入模块达到指定停留时间。此后建立稳态操作，其特征为发酵完成模块的取出与新接种模块的添加同步进行。该移动方向根据操作策略可为上行（底部进料、顶部取出）或下行（顶部进料、底部取出）。
研究结果
发酵过程中的热行为
热调控仍是填充床生物反应器操作的主要技术挑战之一，因为代谢热的积累可能损害酶稳定性和发酵过程的均匀性。本研究考察了批式和连续两种操作制度对 M. thermophila I-1D3b 在木质纤维素底物（SCB:WB，7:3 w/w）上产内切葡聚糖酶过程中床层热行为的影响。图3显示了批式操作、上行连续操作和下行连续操作下4个发酵模块监测温度的时序演变。
如图3所示，整个发酵过程中记录的平均温度保持在45 °C附近，监测点间波动小于4 °C。批式操作下观察到初始温度升高，随后出现热峰并趋于稳定或略有下降——这与固定床系统中代谢热瞬时积累的行为一致。轴向热梯度的形成与单向通气密切相关，表现为温度沿反应器长度的分散。尽管过热程度较轻，但梯度的持续存在可能影响床层内的氧传质和蒸发速率。
连续操作下（图3b和c），热曲线比批式模式呈现更频繁的振荡，反映了发酵模块在整个过程中的间歇性移动。尽管存在这些波动，温度仍保持在批式操作观察到的相似范围内，没有明显热过热的证据。在96至210 h之间，每24 h添加和移除一个模块，系统沿塔体逐级推进，行为接近活塞流反应器。该解释与Mitchell等人的观点一致，即连续PBB操作可能促进床层沿程过程条件的更大均匀性。各操作制度下的最高温度和平均温度相似，峰值分别为48.2 ± 0.6 °C（批式）、48.9 ± 0.7 °C（上行连续）和47.8 ± 0.8 °C（下行连续），平均温度分别为44.7 ± 0.3、44.5 ± 0.4和44.5 ± 0.5 °C，差异无统计学意义（p > 0.05）。这些结果表明，在评价条件下，两种操作模式均使系统保持在所需温度范围附近，无严重过热。
温度维持在接近最适范围的这一结果提示，高床层孔隙率、嗜热微生物的使用以及所采用的模块移动策略共同促进了代谢热的消散。本研究中床层孔隙率为0.764，高于Perez等人在含甘蔗渣和麦麸系统中报道的数值——该研究在孔隙率0.55时观察到约3 °C的温升。相比之下，Ghildyal等人在PBB中用黑曲霉（Aspergillus niger）培养于麦麸上时报道了15 °C的温升。这些比较共同证实，床层的物理结构在固态发酵的热消散和热梯度强度中起决定性作用。
除操作模式外，新模块的引入位置也影响反应器热曲线。图3c显示了新接种模块从反应器上部加入时连续发酵的热行为。在该构型中，热峰集中在PBB上部区域，与图3b中最高峰出现在床层下部和中间区域的曲线形成对比。这一差异表明，新接种模块所占据的位置直接影响系统内热量的空间分布。在图3c中，每24 h记录到的温度下降反映了模块添加、移除和移动的时刻，表征了连续操作中的间歇性制度。由于新模块插入发酵区上部位置，热峰优先出现在反应器较高处，而靠近空气入口的位置随时间热变化较小。这一行为表明模块进料策略改变了PBB中的纵向热分布，因此在系统操作设计中应予以考虑。然而，由于与下游系统集成相关的操作限制，本研究后续连续实验采用上行模式，即模块从反应器下部添加。
酶活与含水量
在批式和上行连续操作下评估了内切葡聚糖酶活性和发酵模块的最终含水量。这些变量的控制对PBB性能至关重要，因为低于10%的水热梯度可能使酶生产率降低30–50%。批式和连续操作的平均内切葡聚糖酶活性相似，分别为95.63 ± 28.37和96.36 ± 4.63 U·g.d.s⁻¹。尽管均值相近，但连续过程中观察到的较低离散度表明发酵模块间酶活的空间均匀性更高。因此，两种操作模式的主要差异与过程的空间均匀性有关，而非平均酶产量水平。
连续操作下的这种均匀性与批式模式中观察到的较大离散形成对比——后者可归因于静态系统特征性的局部水分、温度和氧可用性异质性——从操作角度看，这代表了更高的过程稳健性和可预测性。这种更高均匀性与模块沿反应器的渐进移动有关，使所有模块随时间的推移暴露于热梯度和湿度梯度的所有区域。根据Mitchell等人的观点，连续操作下PBB趋于接近活塞流反应器行为，有利于各层更均匀地暴露于系统内的气相和热条件。这些结果与Rodrigues等人报道的结果一致，他们也在使用SCB:WB 7:3（w/w）底物的PBB中观察到 M. thermophila I-1D3b连续发酵中内切葡聚糖酶活性的更高均匀性。
除酶活外，床层含水量也是系统的关键方面，因为水分含量的降低直接损害SSF中真菌的生长和代谢活性。固体基质的最终含水量（湿基百分比）列于表1。批式操作下，入口辅助模块（IAL）的最终含水量为71.7 ± 1.5%，出口辅助模块（OAL）为53.2 ± 3.1%；发酵模块L1至L4的含水量分别为70.9 ± 0.9%、69.3 ± 2.5%、68.7 ± 1.8%和66.5 ± 2.3%。连续操作下，IAL为70.5 ± 2.1%，OAL为51.8 ± 2.7%；发酵模块L1至L4（连续操作中模块标记顺序不同）分别为70.2 ± 1.2%、69.8 ± 1.9%、68.9 ± 1.5%和67.1 ± 2.0%。两种操作模式下，床层含水量均沿气流方向逐渐降低，但连续模式的模块间差异更小。
CO₂浓度曲线
图5显示了批式模式和连续模式下PBB出口气流中CO₂浓度的重复曲线。批式模式下，CO₂浓度呈现典型的先升后降趋势，在约48 h达到峰值，反映出真菌生长的指数期和随后进入稳定期/衰退期的代谢活动变化。连续模式下，CO₂浓度呈现周期性波动模式，每24 h出现一次峰谷交替，与模块的添加和移除节奏相对应。这种周期性模式进一步证实了连续操作中模块移动策略对微生物代谢活性的直接影响。
连续操作下的酶回收
图6显示了连续操作下PBB中各模块获得的内切葡聚糖酶活性和回收率。提取流速分别为180 L h⁻¹和2400 L h⁻¹。下标“E”表示通过渗透回收的酶活，而无下标的值表示对渗透后固体进行补充提取得到的残余酶活。在180 L h⁻¹的低流速下，各模块的渗透回收酶活较低，大部分酶活仍残留在固体基质中；而在2400 L h⁻¹的高流速下，渗透回收的酶活显著增加。增加渗透水流量显著提升了酶回收效率，表明传质是下游处理性能的关键限制因素。
逐次渗透提取循环中的酶回收
图7显示了从 M. thermophila I-1D3b发酵底物（甘蔗渣:麦麸，7:3 w/w）中每次连续渗透提取循环回收的内切葡聚糖酶活性。柱状图表示平均值 ± 标准差（n = 3）。不同字母表示Tukey检验差异显著（p < 0.05）。随着提取循环次数的增加，每循环回收的酶活逐渐降低，表明大部分可回收酶活在前几个循环中已被提取。
酶浓缩与稳定化
图8显示了内切葡聚糖酶活性与（a）硫酸铵饱和度、（b）乙醇浓度的关系，以及（c）60%和70%饱和度硫酸铵沉淀内切葡聚糖酶的动力学曲线。硫酸铵沉淀从粗提液中回收了总酶活单位的78.7%，酶活达156 U·g.d.s⁻¹，而乙醇在评价条件下导致显著的酶活损失。沉淀后的提取物表现出高热稳定性，在60 °C下孵育24 h后仍保留约92%的酶活。
讨论与解读
本研究系统证明了 M. thermophila I-1D3b在多层填充床生物反应器中以甘蔗渣和麦麸为底物进行固态发酵产内切葡聚糖酶，在批式和连续操作下均具有技术可行性和可重复性。连续操作降低了床层内异质性，促进了发酵模块间酶活的更大均匀性，且未相对于批式操作降低平均产量水平。热曲线保持在物种最适范围附近，最高温度批式为48.2 °C、连续为48.9 °C，表明连续操作未损害系统稳定性。在评价的浓缩策略中，硫酸铵沉淀表现优异，回收率达78.7%，酶活156 U·g.d.s⁻¹，而乙醇在测试条件下导致酶活净损失。沉淀提取物表现出高热稳定性，60 °C下24 h后保留约92%的酶活。整体而言，热控制、渗透提取和下游处理的集成对该平台在二代乙醇链中原位生产纤维素酶的稳健性和适用性至关重要。未来研究应在中试规模验证这些条件并探索互补的纯化策略。
编译者解读
该研究的核心价值在于将“生产—提取—浓缩”三个通常独立优化的环节在同一反应器系统中贯通验证，而非单点优化。连续操作与活塞流行为的类比为固态发酵反应器设计提供了新的工程视角——模块的“移动即混合”策略以机械手段弥补了固态体系缺乏液体搅拌的固有缺陷。值得关注的是，渗透流速对酶回收的显著影响揭示传质限制不仅是发酵阶段的问题，更是下游处理的瓶颈所在。硫酸铵沉淀对比乙醇的优势结果也提示，在酶浓缩方案选择中，“温和”并不等于“高效”。局限在于当前规模仍属实验室级别，模块化设计能否在更大尺度保持均匀性和热控制，尚待中试验证。从合成生物学应用角度看，该平台若与工程菌株的酶系优化相结合，有望进一步缩短“菌株—酶—糖化”链条的迭代周期。
PMID: 42370983