来源：3 Biotech | 编译：DNA Lab Space
导读
漆酶作为一种环境友好的生物催化剂，可氧化多种有机化合物，在工业废水处理领域备受关注。本研究从嗜热地衣芽孢杆菌SO8菌株中，采用三相分配法（TPP）实现了漆酶的高效纯化——仅用一步操作即获得5.65倍纯化倍数和102.07%的回收率，分子量约38.7 kDa。纯化后的漆酶在pH 9.0和70°C下表现出最佳活性，并在宽泛的pH和温度范围内保持稳定。研究还初步评估了该酶对六种染料的脱色能力，为嗜热漆酶在染料废水处理中的应用提供了基础数据。
研究背景
漆酶（苯二酚：氧氧化还原酶，EC 1.10.3.2）是一种含四个铜离子的多酚氧化酶。该酶在将氧气还原为水的过程中，催化单酚、二酚、多酚、芳香族化合物、有机污染物及无机底物的氧化反应。凭借对多种酚类和非酚类化合物的氧化能力，漆酶已成为纺织、造纸（木质素降解）、污染物脱毒、葡萄酒澄清、有机化学合成、生物传感器及酶生物燃料电池阴极反应等领域的重要工业酶。
漆酶结构中含约15–40%的碳水化合物（如葡萄糖、甘露糖、己糖胺和阿拉伯糖），这些糖基赋予酶分子高稳定性。漆酶单体的分子量通常在50–85 kDa范围内，每个单体典型含四种类型的铜离子，广泛存在于真菌、植物、细菌和古菌中。与真菌和植物来源相比，细菌漆酶具有更宽的底物特异性、快速且低成本的制备方式、更宽的最适pH范围、更强的热稳定性和碱性耐受性等优势。尽管细菌漆酶多样性的基因组学研究不断扩展，但对其具体酶学性质的研究仍相对有限。
本研究旨在利用三相分配法这一简单、快速、低成本的生物分离技术，从嗜热地衣芽孢杆菌SO8菌株中纯化漆酶，对其进行全面的酶学表征，并初步评估其染料脱色潜力。
研究方法
菌株与试剂
本研究使用的地衣芽孢杆菌SO8菌株（GenBank登录号：MG076978）由Olmez等人从内夫谢希尔Kozaklı温泉中分离获得，作为漆酶来源。所用全部化学试剂和溶剂均购自德国Merck公司和美国Sigma-Aldrich公司。
酶活与蛋白浓度测定
漆酶活性测定采用改良的Wang等人（2014）方法。具体操作如下：取0.5 mL酶液，与1 mL含0.5 mM ABTS的100 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）混合，在55°C下孵育15 min。对照反应以缓冲液代替酶液进行。酶活性通过分光光度法在420 nm波长下监测ABTS的氧化程度来测定。一个酶活单位（U）定义为每分钟氧化1 µmol ABTS所需的酶量。活性计算按照Baltierra Trejo等人（2015）描述的公式进行。蛋白浓度采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准品（Bradford 1976）。
漆酶的三相分配法纯化
培养液中与漆酶共存细菌细胞通过离心去除（6000 rpm，15 min，4°C），所得匀浆上清液作为TPP的酶源。在漆酶纯化过程中，首先对TPP纯化参数进行优化，包括硫酸铵浓度（20–80% w/v）、匀浆液/叔丁醇比例（1.0:0.5、1.0:1.0、1.0:1.5、1.0:2.0 v/v）和pH（2.0–11.0），以获得最高的纯化效率。
TPP操作流程如下：首先，向2 mL匀浆液中加入不同浓度的硫酸铵，缓慢涡旋混匀；然后按不同比例加入叔丁醇，涡旋30 s。混合物在室温下孵育1 h，随后以6000 rpm离心5 min。离心后观察到三相形成，去除上层叔丁醇相，立即将中间相和下层水相分别收集到不同试管中。分别测定中间相和下层水相的漆酶活性和总蛋白浓度。中间相的蛋白沉淀用0.1 M pH 7.0磷酸钠缓冲液溶解。确定最佳硫酸铵和叔丁醇比例后，将2 mL匀浆液用70%硫酸铵饱和，并用1 M NaOH和1 M HCl调节至不同pH（2.0–11.0），然后加入叔丁醇。按上述方法测定下层相和中间相的漆酶活性和蛋白含量。绘制以活性回收率（%）相对纯化倍数的图表（Birge et al. 2023, Aras et al. 2025）。
SDS-PAGE分析
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析经TPP法部分纯化漆酶的纯度和分子量。电泳过程基于Laemmli（1970）方法，使用12%（w/v）分离胶和4%（w/v）浓缩胶。每孔上样20 µL样品。凝胶电泳先在250 V下运行5–10 min以确保浓缩效果，随后在120 V下运行约90 min使蛋白在分离胶中分离。蛋白条带通过银染显色（20 min）。蛋白分子量标准品（ECOTECH）作为参照。
纯化漆酶的酶学表征
pH和温度的影响
为确定纯化漆酶的最适pH，在0.1 M缓冲液中于pH 2至12范围内评估酶活性。所用缓冲液包括：甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.0–3.0）、乙酸钠缓冲液（pH 4.0–5.0）、磷酸盐缓冲液（pH 6.0–7.0）、Tris-HCl缓冲液（pH 8.0–9.0）和甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 10.0–11.0）。为确定纯化漆酶的最适温度，在20至90°C范围内进行酶活性测定。显示最高活性的pH和温度值设为100%，用于相对活性计算。
pH稳定性评估：将0.5 mL漆酶在不同pH值的缓冲液中孵育2 h，然后测定残余活性，初始活性设为100%。热稳定性评估：将酶在20°C至90°C范围内分别孵育30、60、90和120 min，然后在最适pH（pH 5.0）下使用1.5 mL缓冲液、1 mL底物和0.5 mL酶液测定残余活性。初始活性设为100%用于相对活性计算（Akkaya et al. 2025）。
金属离子、抑制剂和表面活性剂的影响
为研究某些金属离子对漆酶的影响，配制20 mM的金属离子溶液（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺），向每种金属离子溶液中加入0.5 mL纯化漆酶，使最终浓度为1、5和10 mM，孵育30 min后测定剩余漆酶活性。以不含任何金属盐的酶活性作为对照，设为100%（Bilge et al. 2024; Mehandia et al. 2020）。
类似地，研究不同表面活性剂和抑制剂对漆酶的影响：Triton X-100、Tween-20、Tween-80浓度为1%、5%和10%；SDS浓度为5、10和20 mM；以及NaF和EDTA。孵育结束后，以初始活性为100%，测定漆酶的残余活性。
底物特异性
从地衣芽孢杆菌SO8菌株纯化的漆酶的底物特异性，使用多种酚类底物（愈创木酚、单宁酸和L-酪氨酸）和非酚类底物（ABTS）测定。ABTS底物溶液用100 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.0）配制；愈创木酚和单宁酸用50 mM Tris-HCl（pH 7.0）缓冲液配制；L-酪氨酸用50 mM Tris-HCl（pH 7.0）缓冲液配制。漆酶活性最高的底物活性设为100，其他底物的相对活性（%）按此计算。
酶动力学
为确定从地衣芽孢杆菌SO8纯化的漆酶的动力学参数，测定ABTS底物在50–1000 µM范围内不同浓度下的酶活性。用所得值绘制Lineweaver-Burk图，并利用该图计算Km、Vmax、Kcat和催化效率（Kcat/Km）（LaemmLi 1970; Rao et al. 2008）。
染料脱色实验
反应混合物由0.5 mL染料溶液、0.5 mL漆酶和1 mL 0.5 mM ABTS介体溶液组成。混合物在55°C下分别孵育15、30、60和120 min，每次孵育在不同初始pH值（5.0、7.0和9.0）下进行。孵育结束后，剩余染料浓度在最适波长下用分光光度法测定（Bilge et al. 2024）。染料脱色百分比按以下公式计算（Rodríguez et al. 2008）：
脱色率(%) = [(Ci − Ct)/Ci] × 100
其中Ci为染料的初始浓度，Ct为剩余染料浓度。
统计分析
所有涉及从地衣芽孢杆菌SO8分离的漆酶的实验均进行三次重复（n = 3）。数据以平均值±标准差（SD）表示，反映三次独立实验的平均值和变异性。漆酶表征数据的统计分析采用Student双尾t检验，使用GraphPad Prism®软件（版本9.0，GraphPad Software，San Diego，CA）进行。
研究结果
酶的分离与纯化
为获得耐受极端条件的漆酶，本研究选择了本实验室前期分离鉴定的耐热菌株中活性最高的地衣芽孢杆菌SO8菌株。采用TPP这一简单、快速、一步式的生物分离技术，从细菌液体培养物中纯化漆酶，以替代昂贵、耗时、多步骤的传统方法。
首先，为以最高产率从地衣芽孢杆菌SO8菌株中通过TPP法纯化漆酶，对叔丁醇、硫酸铵、pH和比例等参数进行了优化。优化纯化条件对于实现高酶纯度和产率至关重要（Kumar et al., 2011）。图1显示了各参数对匀浆液中漆酶纯化系数和产率的影响。确定的最佳条件为：70%（w/v）硫酸铵浓度、1.0:1.0匀浆液与叔丁醇比例、pH 9.0，获得5.65倍纯化和102.07%的产率（图1）。
表1总结了使用TPP纯化SO8漆酶的总体情况。在优化条件下，TPP有效从地衣芽孢杆菌SO8粗提液中纯化漆酶，实现了102.07%的产率和5.65倍的纯化倍数。叔丁醇浓度的增加导致有机相吸水量增加，提高了水相盐度，从而促进蛋白在界面处沉淀（Zouari-Mechichi et al. 2006）。漆酶在TPP过程中通常分配至界面相（Kumar et al. 2012; Altıntas et al. 2025）。产率超过100%是TPP方法在纯化过程中去除抑制剂并激活酶的结果。此外，TPP过程中使用的硫酸铵和叔丁醇的联合效应可引起酶三维构象的积极变化，使其转变为更具活性的结构。
表1 从B. licheniformis SO8纯化漆酶的纯化表
| 纯化步骤 | 总活性 (EU/mL) | 总蛋白 (mg/mL) | 比活性 (EU/mg) | 回收率 % | 纯化倍数 |
|---------|---------------|----------------|---------------|----------|---------|
| 粗提液 | 72.446 | 0.520 | 139.32 | 100 | 1 |
| TPP-界面相 | 73.948 | 0.094 | 786.68 | 102.07 | 5.65 |
| TPP-水相 | 31.08 | 0.256 | 121.4 | 42.9 | 0.87 |
已有研究证实了TPP用于漆酶纯化可获得高产率的适用性。例如，一项研究报告了糙皮侧耳漆酶的27.8倍纯化和161%产率。Rajeeva和Lele（2011）通过两阶段TPP实现了灵芝属漆酶60%的产率和13.1倍的纯度。Liu等人报道了通过TPP纯化漆酶获得20倍纯度和约75%的产率。与其他常用方法相比——如糙皮侧耳漆酶的硫酸铵沉淀-固定化金属亲和层析（46倍纯化，57.4%产率）（do Rosário Freixo et al. 2012）、灵芝属漆酶的渗滤（3.7倍纯化，90.4%产率）（Rajeeva and Lele 2011）以及Pycnoporus属漆酶的超滤（2.14倍纯化，87%产率）（Lu et al. 2007）——TPP通常展现出更优越的纯化产率。TPP是一种新兴的蛋白质沉淀生物分离技术，能够实现酶的高效纯化和回收（Dennison and Lovrien 1997; Kumar et al. 2012）。与传统层析方法相比，TPP在蛋白酶和淀粉酶等酶的纯化中显示出获得更高纯度的潜力（Saxena et al., 2007）。TPP因其多功能性而日益受到认可，目前广泛用于各工业领域的蛋白质回收（Kumar et al. 2012）。
SDS-PAGE分析
SDS-PAGE分析证实了TPP对漆酶纯化的有效性（图2）。与粗酶提取物（泳道a）和水相（泳道b）相比，仅在界面相（泳道c）观察到单一蛋白条带。这一观察结果强烈表明，TPP有效去除了污染蛋白和其他分子，使目标漆酶富集于界面相。根据SDS-PAGE分析，纯化的地衣芽孢杆菌SO8漆酶的分子量约为38.7 kDa。该分子量落在其他细菌物种漆酶的报道范围内，如B. tequilensis SN4漆酶32 kDa（Sondhi et al. 2014）、Enterococcus faecium A2漆酶50.11 kDa（Birge et al. 2022）和Arthrobacter gonensis P39漆酶160 kDa（Yanmış et al. 2016）。
pH和温度对酶活性和稳定性的影响
从地衣芽孢杆菌SO8菌株纯化的漆酶的最适pH为9.0，表明其为碱性酶（图3A）。该漆酶在宽pH范围（pH 2.0–11.0）内保持超过50%的活性（图3B）。从SO8菌株分离的漆酶在高pH值下保持稳定，在所有pH值下120 min结束时仍保留超过35%的活性。在高pH值下显示活性并保持稳定的漆酶在工业上具有很高的需求。虽然在60 min时观察到相对活性下降，但在120 min时相对活性的恢复和增加表明该酶对极端条件的抗性，代表了初始环境胁迫后的结构恢复和激活过程。来自链霉菌属和Thioalkalivibrio属的耐碱漆酶（Machczynski et al. 2004; Lu et al. 2012; Ausec et al. 2015; Ruijssenaars and Hartmans 2004），大多数源自芽孢杆菌属物种。
为确定地衣芽孢杆菌SO8漆酶的温度谱和稳定性，在20°C至90°C之间进行了研究，结果显示该酶在70°C时表现出最大活性，在20–90°C范围内保持高活性（图3C）。漆酶的活性测定在20°C至90°C范围内进行，持续120 min，按周期性间隔取样。观察到漆酶在所有研究温度下2 h孵育期间均显著保持其活性（图3D）。漆酶的高耐热性是其进化适应的结果，这得益于其含有的密集碳水化合物基团、强二级结构键，尤其是其细菌来源。酶在这些温度范围内长时间不失活非常重要，因为纺织厂的废水可能处于高温状态，冷却水既耗费时间又耗费资源。
先前的研究已证明多种来源漆酶存在显著的热不稳定性。例如，Koschorreck等人（2008）报道一种真菌漆酶在70°C下2 h后活性损失92%，而Halaburgi等人（2011）观察到C. cladosporioides漆酶在80°C下5 min内活性损失52%。相比之下，地衣芽孢杆菌SO8漆酶表现出卓越的热稳定性。这种显著的稳定性表明其具有较强的高温耐受性和较宽的操作温度范围。
金属离子、抑制剂和表面活性剂的影响
研究了各种金属离子（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺）对地衣芽孢杆菌SO8漆酶活性的影响。在1和5 mM浓度的Fe²⁺和Mn²⁺离子存在下，漆酶活性增加。在其他金属离子存在下，酶活性受到不同程度的影响。
表面活性剂和抑制剂的影响如表2所示。
表2 部分表面活性剂和抑制剂对漆酶活性的影响
| 处理 | 浓度 | 残余活性 (%) |
|------|------|-------------|
| 对照 | - | 100 |
| 表面活性剂 (% v/v) | | |
| Triton X-100 | 1 | 82.26 ± 2.65 |
| | 5 | 41.72 ± 5.85 |
| | 10 | 19.92 ± 0.489 |
| Tween-20 | 1 | 100.3 ± 1.495 |
| | 5 | 98.39 ± 7.159 |
| | 10 | 40.79 ± 0.233 |
| Tween-80 | 1 | 119.9 ± 18.875 |
| | 5 | 103.2 ± 11.36 |
| | 10 | 41.72 ± 3.527 |
| 抑制剂 (mM) | | |
| SDS | 5 | 100.8 ± 3.604 |
| | 10 | 92.83 ± 4.404 |
| | 20 | 58.97 ± 8.414 |
| NaF | 5 | 90.54 ± 3.871 |
| | 10 | 79.93 ± 0.998 |
| | 20 | 60.61 ± 8.159 |
| EDTA | 5 | 114.1 ± 13.401 |
| | 10 | 82.97 ± 1.710 |
| | 20 | 49.65 ± 1.456 |
酶动力学
通过测定ABTS底物在50–1000 µM浓度范围内的酶活性，绘制Lineweaver-Burk图，计算得到动力学参数：Km为110 µM，Vmax为19.6 µmol L⁻¹ min⁻¹，kcat为0.048 s⁻¹，kcat/Km为0.44 s⁻¹ mM⁻¹。
染料脱色
在pH 5、7和9条件下，对六种不同染料进行120 min脱色实验。结果显示中等程度的脱色效率，其中对酸性红27（Acid Red 27）的脱色率最高，达到38%。
讨论与解读
本研究成功采用三相分配法从地衣芽孢杆菌SO8中一步纯化漆酶，实现了5.65倍纯化和102%的回收率。TPP被证明是一种快速、经济、高效的替代方案。纯化的漆酶在宽pH范围（2.0–11.0）和温度范围（20–90°C）内表现出显著的稳定性。值得注意的是，该酶在高温下保留了92%的活性，超过了文献中报道的许多细菌漆酶的热稳定性。此外，该酶对多种金属离子（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺）、化学物质/抑制剂（NaF和EDTA）和表面活性剂（SDS、Triton X-100、Tween-20、Tween-80）表现出显著的耐受性。这种稳健的稳定性，加上其广泛的活性谱和脱色潜力，使地衣芽孢杆菌SO8漆酶成为多种工业应用（特别是生物修复领域）的有前景候选酶。
编译者解读
本研究展示了TPP技术在工业酶纯化中的实用价值——单步操作即实现5.65倍纯化和超100%的活性回收，相比传统多步层析大幅缩短了工艺链条。该漆酶突出的碱性和热稳定性（pH 9.0最适、70°C保持高活性）特别契合纺织废水的高温碱性环境，避免了冷却工序的额外成本。不过，38%的最高染料脱色率仍偏低，且实验依赖ABTS介体，实际废水体系中的表现需要进一步验证。今后若能在酶工程改造（如提高非介体依赖的氧化能力）和反应器放大方面推进，这类嗜热细菌漆酶的工业落地前景值得期待。
参考来源
Yıldıran S, Aygün E, Altıntaş R, Şişecioğlu M. Purification of laccase from thermophilic Bacillus licheniformis SO8 with three-phase partitioning, characterization, and usage in dye decolorization. 3 Biotech. PMID: 42179929.
PMID: 42179929