代谢工程改造斯达克油脂酵母高效合成维生素A

📅 2026-08-12 📰 Microb Cell Fact 2026 May 12 📂 研究进展 👁 17

来源：Microb Cell Fact | 编译：DNA Lab Space

导读

维生素A是维持视觉、免疫和细胞分化所必需的微量营养素，传统化学合成法面临严峻环境挑战。本研究首次将斯达克油脂酵母（Lipomyces starkeyi）工程化为维生素A生产菌株，通过引入β-胡萝卜素和类视黄醇合成途径的关键酶，结合甲羟戊酸途径强化与双相发酵策略，在3-L补料分批发酵中实现超过600 mg/L的维生素A产量，其中90%以上分泌至胞外。该工作为可持续维生素A生产提供了新平台。

研究背景

维生素A作为人体必需微量营养素，在视觉、免疫功能和细胞分化中发挥关键作用。传统维生素A生产以化学合成为主，但工艺流程带来显著环境负担。微生物发酵虽为可持续替代方案，其产量和成本效益尚难与化学合成抗衡。产油酵母——如斯达克油脂酵母——能够合成高水平的乙酰辅酶A和脂质，是生产维生素A等高价值亲脂性化合物的理想底盘。本研究首次将斯达克油脂酵母工程化为维生素A生产菌株，通过引入β-胡萝卜素和类视黄醇生物合成途径的关键酶，系统优化甲羟戊酸途径与发酵条件，实现了维生素A的高效生产。

研究方法

菌株与培养基

本研究所用酵母菌株列于表1。采用同源重组效率增强的斯达克油脂酵母∆lslig4菌株（源自CBS1807）构建维生素A生产菌株。酿酒酵母改造以YPH499（Stratagene，美国加州）为亲本。斯达克油脂酵母和酿酒酵母于30°C在YPD培养基（1% Bacto™酵母提取物（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）、2% Bacto™蛋白胨（Thermo Fisher Scientific）和2%葡萄糖）中培养。固体培养基添加2% Bacto™琼脂（Thermo Fisher Scientific），可选补充100 μg/mL Geneticin™（Thermo Fisher Scientific）、100 μg/mL潮霉素B（FUJIFILM Wako Pure Chemical，日本）、30 μg/mL诺尔丝菌素（FUJIFILM Wako Pure Chemical）和/或50 μg/mL Zeocin™（Invitrogen Corporation，美国加州）。酿酒酵母菌株于30°C在合成限定（SD）培养基中培养，该培养基含0.17%酵母氮碱（不含氨基酸和硫酸铵，Thermo Fisher Scientific）、0.5%硫酸铵（Nacalai Tesque，日本）、2%葡萄糖和0.14%酵母合成 dropout 补充物（不含尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸和色氨酸，Sigma-Aldrich，美国密苏里州）。根据需要向培养基中添加尿嘧啶（100 μg/mL）、亮氨酸（30 μg/mL）、色氨酸（80 μg/mL）和组氨酸（100 μg/mL）（FUJIFILM Wako Pure Chemical）。固体培养基添加2% Bacto™琼脂。

表1 本研究所用酵母菌株

斯达克油脂酵母：

| 菌株名称 | 亲本菌株 | 描述 | 来源 |

|---|---|---|---|

酿酒酵母：

| 菌株名称 | 亲本菌株 | 描述 | 来源 |

|---|---|---|---|

| YPH499 | — | MATa ura3-52 lys2-801_amber ade2-101_ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 | Stratagene |

| KHNU-S1 | YPH499 | YPH499, Δhmg1::PTDH3-tHMG1-TTDH3-PPGK1-KanR-TPGK1 | 本研究 |

大肠杆菌HST08（Takara Bio，日本）用于基因克隆和质粒扩增，于37°C在含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基（1%胰蛋白胨（Thermo Fisher Scientific）、0.5% Bacto™酵母提取物和0.5% NaCl）中培养。

通用分子生物学技术

聚合酶链式反应（PCR）使用KOD Fx Neo和KOD One DNA聚合酶（TOYOBO，日本）进行，按制造商说明操作。基因组DNA使用Gen Toru-Kun酵母试剂盒（Takara Bio）提取，质粒DNA使用QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，德国）提取。限制性内切酶购自Takara Bio。

质粒与菌株构建

质粒和菌株构建所用引物列于表S1。异源基因包括来自未培养海洋细菌66A03的Blh（MbBlh）、来自卷枝毛霉的CarRP和CarB（McCarRP和McCarB）、以及来自红发夫酵母的CrtE（XdCrtE），均按斯达克油脂酵母密码子优化后由Eurofins Genomics（日本）合成（表S2）。来自巴豆的XdCrtE和CsPDP基因（均按酿酒酵母密码子优化）由Eurofins Genomics合成（表S2）。

为构建酿酒酵母菌株KHNU-S1，基因组整合盒pBlue-PTDH3-tHMG1-TTDH3-PPGK1-KanR-TPGK1的组装步骤如下。首先，以酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，使用引物对ScHMG1_us_F/cHMG1_us_R和ScHMG1_ds_F/ScHMG1_ds_R分别扩增HMG1的5′和3′非翻译区（UTR）。以pBluescript II KS(+)为模板，用pBlue_F1/pBlue_R1引物扩增载体骨架。这些DNA片段使用In-Fusion® Snap Assembly Master Mix（Takara Bio）连接，生成pBlue-HMG1us-HMG1ds。接下来，以YPH499基因组DNA为模板，分别用引物对PGK1p_F/PGK1p_R和PGK1t_F/PGK1t_R扩增PGK1启动子和终止子。以质粒pGKNEO2 [31]为模板，用G418r_F1/G418r_R1引物扩增KanR基因。以pBluescript II KS(+)为模板，用pBlue_F2/pBlue_R2引物扩增载体骨架。所得DNA片段经In-Fusion® Snap Assembly Master Mix连接，构建pBlue-lox71-PGK1p-KanR-PGK1t-lox66。最后，以pBlue-HMG1us-HMG1ds为模板，用pBlue_HMG1_vec_F/pBlue_HMG1_vec_R引物扩增载体骨架；以pBlue-lox71-PGK1p-KanR-PGK1t-lox66为模板，用G418r_F2/G418r_R2引物扩增KanR表达盒；以pARS308-ERG12-tHMG1-URA [32]为模板，用ScHMG1_F/ScHMG1_R引物扩增tHMG1表达盒。上述DNA片段经In-Fusion® Snap Assembly Master Mix组装，获得最终质粒pBlue-PTDH3-tHMG1-TTDH3-PPGK1-KanR-TPGK1。

为构建酿酒酵母表达质粒pYES2(LEU2)-CsPDP、pYES2(HIS3)-LsGGS1和pYES2(HIS3)-XdCrtE，首先将亲本载体pYES2/CT中的标记基因URA3替换为LEU2或HIS3，分别生成pYES2(LEU2)-empty和pYES2(HIS3)-empty。LEU2和HIS3 DNA片段分别以酿酒酵母基因组DNA为模板，用引物对LEU2_F/LEU2_R和HIS3_F/HIS3_R扩增。所得PCR产物与用引物pYES2CT_F/pYES2CT_R扩增的pYES2/CT骨架片段经In-Fusion® Snap Assembly Master Mix组装，获得pYES2(LEU2)-empty和pYES2(HIS3)-empty。

为构建pYES2(LEU2)-CsPDP，以Eurofins Genomics合成的酿酒酵母密码子优化CsPDP基因为模板，用引物CsPDP_Sc opt_F/CsPDP_Sc opt_R扩增，与用pYESCT_F2/pYESCT_R2引物扩增的pYES2(LEU2)-empty骨架经In-Fusion® Snap Assembly Master Mix组装。为构建pYES2(HIS3)-LsGGS1和pYES2(HIS3)-XdCrtE，以斯达克油脂酵母cDNA为模板用LsGGS1_Sc opt_F/LsGGS1_Sc opt_R引物扩增LsGGS1，以Eurofins Genomics合成的酿酒酵母密码子优化XdCrtE基因为模板用XdCrtE_Sc opt_F/XdCrtE_Sc opt_R引物扩增。各扩增基因片段与用引物pYESCT_F2/pYESCT_R2扩增的pYES2(HIS3)-empty骨架经In-Fusion® Snap Assembly Master Mix组装，获得pYES2(HIS3)-LsGGS1和pYES2(HIS3)-XdCrtE。

酿酒酵母菌株KHNU-S1通过将pBlue-PTDH3-tHMG1-TTDH3-PPGK1-KanR-TPGK1质粒经XhoI酶切并纯化后转化细胞而构建。KHNU-S2通过将pYES2(LEU2)-CsPDP和pYES2(HIS3)-empty载体导入KHNU-S1生成。同样，KHNU-S3和KHNU-S4分别通过将pYES2(LEU2)-CsPDP与pYES2(HIS3)-LsGGS1和pYES2(HIS3)-XdCrtE共转化KHNU-S1获得。

为构建斯达克油脂酵母菌株KHNU-1和KHNU-2的β-胡萝卜素生产质粒，开发了表达盒pKS/lig4/McCarRP-McCarB和pKS/tgl3/XdCrtE。对于pKS/lig4/McCarRP-McCarB，以斯达克油脂酵母基因组DNA为模板扩增以下DNA片段：LsLIG4的5′和3′UTR（引物：lig4_us_F/lig4_us_R和lig4_ds_F/lig4_ds_R）、70486启动子和终止子——原文此处未详述后续扩增细节。

▲ 图1｜在Lipomyces starkeyi中为维生素A生物合成设计的代谢通路概览。示意图展示了L. starkeyi中MVA通路、β-胡萝卜素合成、维生素A（类视黄醇）合成与TAG代谢之间的代谢网络连接。MVA通路（粉色）产生萜类前体DMAPP和IPP，并缩合为GPP、FPP和GGPP。β-胡萝卜素通路（黄色）通过来自Mucor circinelloides的八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶（McCarRP）和八氢番茄红素脱氢酶（McCarB）将GGPP转化为β-胡萝卜素。来自Xanthophyllomyces dend……

研究结果

本研究首次将斯达克油脂酵母工程化为维生素A生产菌株，通过引入β-胡萝卜素和类视黄醇生物合成途径的关键酶实现目标产物合成。具体策略包括整合编码番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶（McCarRP）、八氢番茄红素脱饱和酶（McCarB）和β-胡萝卜素15,15′-双加氧酶（MbBlh）的基因。进一步优化甲羟戊酸途径后，在3-L补料分批发酵中实现超过600 mg/L的维生素A产量。Fe²⁺补充可提高产量，采用十二烷和丁基羟基甲苯的双相培养系统增强了维生素A的回收效率，超过90%的产物在胞外相中回收。

▲ 在Lipomyces starkeyi中构建β-胡萝卜素和维生素A生物合成途径并评估MbBlh拷贝数对维生素A产量的影响。A L. starkeyi Δlslig4（对照）、KHNU-1和KHNU-2菌株的表型比较，显示随着异源β

▲ Enhancement of vitamin A production in Lipomyces starkeyi through reinforcement of the MVA pathway. A Effects of overexpression of HMG1 and truncated HMG1 ( tHMG1 ) on vitamin A production after 96 h of cultivation. The KHNU-3 strain was used as the parental control. Retinal (filled bars) and retino

▲ 碳源和Fe²⁺补充对Lipomyces starkeyi KHNU-7维生素A生产的影响。A不同碳源对工程菌L. starkeyi KHNU-7维生素A生产的影响。细胞在YP培养基中培养，添加2%（w/v）各指示碳源，两相培养含20%（v/v）十二烷（含1%（w/v）BHT），培养96小时。视黄醛（实心条）和视黄醇（空心条）分别显示。B补充Fe²⁺对96小时后维生素A生产的影响。KHNU-7在YPD培养基中培养，FeSO₄浓度变化为0–2.8 mM。

▲ 工程化Lipomyces starkeyi KHNU-7菌株生产维生素A的补料分批发酵。168小时培养期间细胞生长（OD600）、胞外和胞内维生素A、胞内β-胡萝卜素、葡萄糖浓度及胞内三酰甘油（TAG）的时间进程曲线。胞外视黄醛和视黄醇以单独虚线显示，以区分其在发酵过程中的动态变化。数据为三次独立实验的平均值±SEM。TAG三酰甘油，SEM平均值的标准误。

讨论与解读

本研究确立了斯达克油脂酵母作为可持续维生素A生产平台的潜力。尽管产量已获显著提升，但途径调控和发酵条件仍需进一步优化方能达到经济竞争力水平。这些发现为将斯达克油脂酵母开发为维生素A及其他高价值萜类化合物的大规模生产平台奠定了基础。

编译者解读

该研究选择斯达克油脂酵母作为底盘具有独到之处——其天然的高乙酰辅酶A和脂质合成通量为亲脂性萜类产物提供了充足前体，而双相培养策略巧妙解决了维生素A的胞外回收难题。90%以上的胞外分配比例大幅降低了下游纯化成本，这是迈向工业化的重要一步。不过，600 mg/L的产量与化学合成相比仍有差距，MVA途径的代谢通量分配和产物毒性耐受性或是未来优化的关键节点。该平台的可扩展性值得后续发酵工艺研究者持续关注。

参考来源

Kinoshita A, Sato R, Higuchi H, Kobayashi S, Koketsu K. Efficient vitamin A production in Lipomyces starkeyi through metabolic engineering of the β-carotene and retinoid pathways. Microb Cell Fact. PMID: 42121163. DOI: 10.1186/s12934-026-03020-y.

PMID: 42121163

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