来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
利用酵母作为细胞工厂生产工业酶和药用蛋白已成为合成生物学的重要方向，然而分泌效率低下长期制约着产量提升。近期，西班牙研究团队在《Cellular and Molecular Life Sciences》发表了一项突破性成果，通过对经典的α因子交配分泌信号肽进行理性改造，设计出一种性能大幅提升的通用型信号肽。该设计不仅使多种异源蛋白的分泌量显著增加，还在不同酵母菌株中展现出广谱适用性，为高值蛋白的绿色制造提供了全新解决方案。
研究背景
酵母表达系统，尤其是毕赤酵母（*Pichia pastoris*）和酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*），兼具原核系统操作简便和真核系统可进行翻译后修饰的双重优势，已被广泛用于重组蛋白生产。在酵母分泌途径中，蛋白质的胞外分泌高度依赖于N端信号肽的引导。信号肽如同蛋白质的“邮政编码”，能够指引新生肽链进入内质网，经高尔基体加工后最终运输至胞外。其中，来源于酿酒酵母α交配因子（α-factor）的前导肽是最为经典的分泌信号之一，长期以来作为“金标准”被用于多种酵母表达载体。
然而，天然α因子信号肽并非完美无缺。在实际应用中，其介导的分泌效率在不同蛋白间差异巨大，部分蛋白的分泌水平极低，甚至完全不能分泌。研究表明，信号肽的疏水性核心、前肽（pro-peptide）的长度与糖基化修饰、信号肽酶切割位点的可及性等因素均会影响分泌过程的整体效率。此外，翻译后修饰中的内质网应激、错误折叠和胞内降解也常常成为限速步骤。因此，如何突破天然信号肽的性能瓶颈，设计出能兼容多种蛋白底物的高效、通用分泌信号肽，成为该领域亟待解决的科学问题。
在这一背景下，Pablo Aza等人将目光投向了α因子信号肽的序列优化。他们并未采用传统的随机突变和筛选策略，而是基于对分泌机器识别和加工机制的深刻理解，采用半理性的设计思路，通过调整前肽区域的N-糖基化位点分布和优化信号肽切割效率，成功获得了一种名为“SP23”的改良信号肽。该研究不仅大幅提升了多种酶蛋白在酵母中的分泌产量，更为信号肽的工程化改造提供了全新范式。
研究方法
该研究实验设计严谨、技术路线清晰，综合运用了分子生物学、合成生物学和生物化学等多学科手段，核心流程可归纳为以下四个步骤。
**1. 信号肽设计与序列优化**
研究团队首先对酿酒酵母α因子的pre-pro信号肽进行序列分析，重点关注pre区（引导进入内质网）和pro区（辅助折叠与转运）的功能分工。基于前期研究积累，他们假设pro区中的三个N-糖基化位点在分泌过程中起到分子伴侣样作用，可帮助蛋白质正确折叠，但过多的糖基化可能会造成空间位阻。因此，他们在α因子原始序列基础上，对N-糖基化位点的数目和位置进行精细调整，同时修饰信号肽酶Kex2和Ste13的切割位点，使pro区能被高效切除。最终设计的SP23信号肽在pre区保持了疏水核心的完整性，在pro区引入了更为均衡的糖基化分布，并在C端引入更易被切割的酸碱性氨基酸序列。所有设计均通过基因合成获得编码序列，并克隆至表达载体。
**2. 重组表达载体构建与酵母转化**
为系统评价SP23的通用性，研究者选取了多种不同来源、不同分子量和不同等电点的酶蛋白作为报告蛋白，包括真菌漆酶、过氧化物酶和酯酶等。将这些蛋白的编码基因分别与SP23或野生型α因子信号肽融合，构建到毕赤酵母表达载体中。载体线性化后通过电穿孔法转化入毕赤酵母X-33和SMD1168等多种宿主菌株，筛选高拷贝整合的转化子。
**3. 多尺度分泌表达筛选与条件优化**
转化子首先在微量滴定板中进行小规模培养和甲醇诱导表达，通过高通量酶活测定快速筛选分泌水平优异的克隆。阳性克隆进一步在摇瓶和5 L发酵罐中放大培养，系统比较SP23与野生型信号肽在细胞生长、蛋白分泌量和分泌效率上的差异。在此过程中，采用SDS-PAGE和Western blot分析胞外培养上清中的重组蛋白水平，结合相应的酶活测定方法（如以ABTS为底物测定漆酶活性）进行准确定量。
**4. 糖基化分析和分泌动力学监测**
为探明SP23促进分泌的分子机制，研究团队利用内切糖苷酶H（Endo H）和肽-N-糖苷酶F（PNGase F）处理分泌蛋白，通过电泳迁移率变化分析N-糖基化修饰程度。同时，在诱导后不同时间点取样，监测胞内和胞外的酶活分布，解析SP23对蛋白折叠效率、内质网输出速率以及最终外排步骤的影响。系列实验从翻译后加工和转运动力学层面，揭示了改良信号肽功能增强的深层原因。
研究结果
论文报告了一系列扎实且令人瞩目的实验结果，集中展示了SP23作为通用型信号肽的巨大优势。
首先，在摇瓶水平上，与野生型α因子信号肽相比，SP23介导的多种真菌漆酶分泌量均提升了2～8倍不等。例如，一种高氧化还原电位的担子菌漆酶在野生型信号肽引导下几乎检测不到胞外活性，而融合SP23后摇瓶上清的酶活达到每升数十单位，实现了从“不可分泌”到“高效分泌”的飞跃。对于酯酶和过氧化物酶等其他酶类蛋白，分泌水平也获得了1.5～5倍的显著增高。值得注意的是，这种增强效应并不依赖于蛋白的种类或来源，展现出极好的底物通用性。
在发酵罐高密度培养中，SP23的优越性更加凸显。融合SP23的漆酶工程菌株在5 L发酵罐中分泌酶活最高可达每升数千单位，较野生型信号肽提高了近一个数量级。发酵上清液经SDS-PAGE可见清晰的目的蛋白条带，且杂质蛋白含量低，表明改造后的信号肽不仅促进分泌，而且维持了较高的切割精确性，产生的成熟蛋白N端均一。
糖基化分析揭示了SP23性能提升的部分分子机理。野生型α因子前肽带有3个高度糖基化位点，容易形成庞大的糖链簇，可能阻碍信号肽酶的正确识别和切割。而SP23通过减少一个糖基化位点和改变剩余位点的相对位置，显著降低了前肽的糖链体积。Endo H消化实验表明，SP23融合蛋白的糖基化更为均一且切割效率显著提高。细胞内酶活的动态监测进一步显示，携带SP23的蛋白在内质网中的滞留时间缩短，进入后高尔基体区室的速率加快，最终导致胞外分泌量的显著积累。这证实了通过平衡前肽糖基化程度和优化切割动力学，能够有效疏通分泌通路的限速瓶颈。
此外，研究者还在不同酵母菌株（如X-33、SMD1168以及酿酒酵母BY4742）中验证了SP23的功能。结果显示，SP23在所有测试菌株中均表现出比野生型信号肽更强的分泌驱动能力，说明其性能不受遗传背景差异的显著影响，真正实现了“通用型”设计目标。
讨论与展望
该研究的科学意义在于首次系统地证明，通过理性调整α因子前肽的N-糖基化位点数目和分布，可以大幅度改善信号肽的加工效率，进而提升异源蛋白在酵母中的分泌产量。这一发现打破了此前将野生型α因子信号肽视为不可随意改动的“黑箱”的观念，为信号肽工程提供了可推广的设计准则：适度削减过大的糖链修饰，并优化信号肽酶切割可及性，是提高分泌效率的有效策略。
从产业应用角度看，SP23信号肽的开发对于工业酶、生物制药和合成生物学领域具有重要价值。目前，许多高附加值蛋白在酵母中的分泌表达水平依然偏低，难以满足工业化生产的经济性要求。SP23作为一种广谱高效的分泌工具，有望被直接整合到商业表达载体中，为不同蛋白的规模化生产提供通用的“加速器”。
然而，该技术仍面临一些挑战。例如，虽然SP23对大部分测试蛋白效果显著，但是否对所有蛋白均具有同等提升作用仍待更大规模的蛋白组学验证。另外，信号肽的改造可能会影响宿主细胞整体的分泌压力，长期高表达条件下的细胞稳定性和工艺重复性也需要在更大规模的工业发酵中进一步评估。
未来，结合计算和深度学习对信号肽序列进行更为精准的预测和设计，或将催生性能更加卓越的第二代通用信号肽。同时，将SP23与内质网折叠伴侣共表达、囊泡运输途径改造等其他分泌工程策略联用，有望在酵母细胞工厂中实现更高水平的蛋白质分泌，为绿色生物制造注入强大动力。
参考来源
Aza P, Molpeceres G, de Salas F, et al. Design of an improved universal signal peptide based on the α-factor mating secretion signal for enzyme production in yeast. *Cellular and Molecular Life Sciences*, 2021. DOI: 10.1007/s00018-021-03793-y.
DOI: 10.1007/s00018-021-03793-y