来源：Bioprocess Biosyst Eng | 编译：DNA Lab Space
导读
第二代生物乙醇的工业化进程长期受制于纤维素酶的高成本。本研究以嗜热真菌 Myceliophthora thermophila I-1D3b 为核心，在多层填充床生物反应器中系统评估了批式与连续操作模式下内切葡聚糖酶的生产、提取与浓缩全链条。连续操作将酶活变异系数从批式的近30%压缩至5%以内，硫酸铵沉淀实现78.7%的酶活回收率。该集成策略为木质纤维素 biorefinery 的酶自给提供了可行路径。
研究背景
循环生物经济倡导将有机副产物转化为能源与高值生物产品。木质纤维素 biorefinery 作为关键技术平台，其经济性高度依赖糖化用纤维素酶的成本。现场产酶（in situ cellulase production）被视为降低对外部商业酶制剂依赖的战略路径。固态发酵（SSF）因可直接利用农业工业副产物、用水量远低于液态发酵，且契合循环经济原则而备受关注。在各类反应器构型中，填充床系统因设计简单、放大潜力明确而具有吸引力。然而，传热效率低、反应器操作复杂以及下游处理瓶颈仍制约着 SSF 的规模化应用。本研究针对这些问题，在多层填充床反应器中集成生产、提取、回收与稳定化四个环节，系统考察批式与连续操作模式对嗜热真菌产酶全过程的影响。
研究方法
微生物与底物
产纤维素酶菌株为嗜热真菌 Myceliophthora thermophila I-1D3b。该菌株最初分离自巴西 Usina Guarani（Olímpia, SP, Brazil）的甘蔗渣堆，前期摇瓶与反应器实验已证实其优异的纤维素酶生产能力。
孢子悬液制备：菌株接种于含60 mL Sabouraud Dextrose Agar（SDA）培养基的斜面试管中，在生化需氧量培养箱（Model SL 200, Solab, Brazil）中45°C培养至少48 h以完成菌丝生长与产孢。培养结束后，用100 mL无菌营养液轻轻刮取琼脂表面孢子。营养液pH调至5.0，成分（w/v）为：0.35% (NH₄)₂SO₄、0.30% KH₂PO₄、0.05% MgSO₄·7H₂O、0.05% CaCl₂、0.10% Tween 20。孢子悬液标准化至每克干固体（g.d.s）1 × 10⁷个孢子。
固体底物选用甘蔗渣（SCB）与麦麸（WB）。SCB由 Usina Ipiranga Agroindustrial S.A.（Brazil）提供，WB购自当地供应商（Agropecuária Claro, São Carlos, SP, Brazil）。SCB在对流烘箱（Model 035, Marconi, Brazil）中60°C干燥至含水量10–15%（水分分析仪 M5 Thermo, Bel Engineering, Monza, Italy测定），随后过筛（5 × 5 mm 与 4 × 2 mm筛网）。WB直接使用，含水量12%（湿基），平均粒径≤1.8 mm。
填充床反应器固态发酵
SSF实验在填充床反应器（PBB）中进行。该系统为不锈钢材质，由底部带孔的圆柱形模块组成，模块尺寸：长10 cm、内径13 cm、外径15 cm。每个模块的环形空间作为水夹套，实现床层温度控制并缓解填充床SSF中常见的过热现象。
过程空气由压缩机供给，依次通过针阀、生物过滤器、AppliTech®流量计（Asa, Italy），进入填充玻璃珠的夹套柱。玻璃珠间隙充满维持在操作温度的蒸馏水，使空气在进入反应器前达到饱和，以最大限度减少SSF过程中的床层过度干燥。反应器出口处，气体经过除湿系统——冷凝收集器连接接收瓶，后接硅胶柱（直径5.2 cm，高39 cm），将出口空气相对湿度降至15%以下，以满足CO₂浓度测量的要求（Vaisala Carbocap探头，Vantaa, Finland）。
反应器垂直放置，包含入口模块（IL）与出口模块（OL），两者均带夹套，外部尺寸与中间发酵模块一致，但内部为锥形几何结构。操作时空气自下而上通过固定床。入口模块位于系统底部，填充玻璃珠以促进气流均匀分布；出口模块空置以利气体流动。另设两个辅助模块，分别填充湿粗甘蔗渣（IAL）与干粗甘蔗渣（OAL），用于减少发酵模块的过度失水并吸收出口模块壁面冷凝水。每个辅助模块填充90 g粗SCB。
操作温度维持45°C——该温度已被报道为 M. thermophila 产内切葡聚糖酶的最适温度。发酵时间96 h。实验过程中，过程空气与循环水均通过模块与加湿器夹套中的水循环维持在45°C（恒温水浴 model SL-152, Solar, Brazil），渗透空气流量固定为250 L h⁻¹，以增强氧传递并维持整个床层适宜的湿度条件。
发酵温度曲线通过T型热电偶实时监测，热电偶经法兰安装于每个发酵模块的入口与出口，探头尖端位于模块径向中心，信号由 National Instruments COMPAQ-DAQ 数据采集系统记录，LabVIEW软件（National Instruments, Austin, USA）控制运行。
模块添加、移除与重新定位期间，固体底物短暂暴露于实验室环境，但所有操作均在无菌条件下进行以最大限度减少微生物污染。底物与营养液分别在121°C高压灭菌20 min。冷却后在经紫外灭菌的超净工作台中将各组分与孢子悬液混合均质。空气过滤器与加湿装置在每次发酵前均灭菌。
发酵培养基为SCB:WB = 7:3（w/w），与前期 M. thermophila I-1D3b 研究一致。含水量调至75%（湿基），添加营养液与接种物悬液至每克干固体1 × 10⁷个孢子。每个发酵模块填充130 g干底物。
操作模式
为评估操作模式（批式与连续）对生物过程性能的影响，实验在两种构型下进行，连续操作分为上行与下行两种模式。
批式培养：发酵开始时PBB即组装全部发酵模块，保持同一构型至96 h终了。该条件作为与连续模式比较的参考。4天发酵使用4个发酵模块，标记为L1、L2、L3、L4。
连续模式：模块每24 h逐个添加，依次完成接种、装填、耦合至PBB。初始阶段床高逐渐增加，直至首个插入模块达到指定停留时间。此后进入稳态操作——移除已发酵模块与添加新接种模块同步进行。模块运动方向根据操作策略分为上行（底部进料、顶部出料）或下行（顶部进料、底部出料）。
研究结果
发酵过程中的热行为
热调控是填充床反应器操作的主要技术挑战之一，代谢热积累可能损害酶稳定性与发酵过程均一性。研究考察了批式与连续操作对 M. thermophila I-1D3b 在木质纤维素底物（SCB:WB = 7:3 w/w）上产内切葡聚糖酶过程中床层热行为的影响。图3显示了批式（图3a）、上行连续（图3b）与下行连续（图3c）操作下四个发酵模块的温度时间演变。
如图3所示，整个发酵期间记录的平均温度接近45°C，各监测点间差异小于4°C。批式操作下，初始温度升高，随后出现热峰，再后趋于稳定或略有下降——这与固定床系统中代谢热的瞬态积累行为一致。轴向热梯度的形成与单向通气内在相关，表现为温度沿反应器长度的离散分布。尽管过热程度轻微，梯度的持续存在可能影响床层内氧传质与蒸发速率。
连续操作（图3b与3c）下，热剖面较批式更频繁波动，反映了发酵模块间歇移动过程。尽管存在波动，温度仍保持在批式操作观察到的相似范围内，无相关热过热的证据。96–210 h期间，每24 h添加与移除一个模块，系统以模块沿柱连续推进方式运行，行为接近活塞流反应器。该解释与Mitchell等[25]一致——连续PBB操作可促进床层过程条件更均匀。
各操作模式的最大与平均温度相近：峰值温度分别为48.2 ± 0.6°C（批式）、48.9 ± 0.7°C（上行连续）、47.8 ± 0.8°C（下行连续），平均温度分别为44.7 ± 0.3、44.5 ± 0.4、44.5 ± 0.5°C，差异无统计学意义（p > 0.05）。两种操作模式均使系统维持在接近目标热范围的状态，无严重过热。
温度维持在接近最适范围，提示高床层孔隙率、嗜热微生物的选用以及模块移动策略的组合有利于代谢热消散。本研究中床层孔隙率为0.764，高于Perez等[26]报道的甘蔗渣与麦麸体系（孔隙率0.55时温度上升约3°C）。相比之下，Ghildyal等[27]报道 Aspergillus niger 在麦麸填充床中培养时温度升高达15°C。这些比较证实床层物理结构在固态发酵热消散与热梯度强度中起决定性作用。
除操作模式外，新模块的引入位置同样影响反应器热剖面。图3c显示新接种模块从反应器上部加入时，热峰集中在PBB上部区域，与图3b中热峰出现在床层下部与中部区域的剖面形成对比。该差异表明新接种模块的占据位置直接影响系统内热量的空间分布。
图3c中每24 h记录的温度骤降反映模块添加、移除与移动的时刻，表征连续操作间歇式运行特征。新模块从发酵区上部插入后，热峰优先出现在反应器较高位置，而靠近空气入口的位置随时间热变化较小。模块进料策略改变了PBB中的纵向热分布，应在系统操作设计中予以考虑。然而，由于与下游系统集成的操作限制，本研究后续连续实验均采用上行模式，即模块从反应器下部添加。
酶活与含水量
批式与上行连续操作下发酵模块的内切葡聚糖酶活与最终含水量如图4a与4b及表1所示。这些变量的控制对PBB性能至关重要——水热梯度低于10%时酶生产率可能降低30–50%[28]。批式与连续操作的平均内切葡聚糖酶活相近，分别为95.63 ± 28.37 与 96.36 ± 4.63 U·g.d.s⁻¹。尽管均值相近，连续过程中观察到的更低离散度表明各发酵模块间酶活的空间均一性更好。两种操作模式的主要差异在于过程的空间均匀性，而非平均产酶水平。
连续操作下的均一性与批式模式下更大的离散度形成对比——后者可归因于静态系统特征性的水分、温度与氧可利用性局部异质性。从操作角度看，这代表了更高的过程鲁棒性与可预测性。模块沿反应器渐进移动，使所有模块随时间暴露于热梯度与湿度梯度的全部区域，从而实现更高均匀性。据Mitchell等[25]，连续操作下PBB趋向活塞流反应器行为，有利于各层更均匀地暴露于气相与热条件。
这些结果与Rodrigues等[10]的报道一致——他们同样观察到 M. thermophila I-1D3b 在SCB:WB 7:3底物的PBB连续发酵中内切葡聚糖酶活具有更高均一性。
除酶活外，床层含水量同样是系统关键因素——水分含量下降直接损害SSF中真菌生长与代谢活性。固体基质最终含水量（湿基%）见表1。
连续操作中CO₂剖面
批式与连续模式下出口气流CO₂浓度的重复测定结果如图5所示。CO₂浓度作为代谢活性的实时指标，反映了两种操作模式下微生物呼吸活动的差异。
连续操作下酶活回收
图6显示了连续操作下PBB各模块获得的内切葡聚糖酶活与回收率。提取流量分别为180 L h⁻¹（图6a）与2400 L h⁻¹（图6b）。下标"E"表示渗透回收的酶活，无下标数值表示渗透固体补充提取的残余酶活。
提高渗透水流量显著增强了酶回收效率，表明传质是下游处理性能的关键限制因素。
顺序渗透提取循环
图7显示了从 Myceliophthora thermophila I-1D3b 发酵底物（甘蔗渣:麦麸 = 7:3 w/w）中每个顺序渗透提取循环回收的内切葡聚糖酶活。数据以均值 ± 标准差表示（n = 3），不同字母表示Tukey检验差异显著（p < 0.05）。
酶浓缩
图8显示了内切葡聚糖酶活随（a）硫酸铵饱和度、（b）乙醇浓度的变化，以及（c）60%与70%饱和度硫酸铵沉淀内切葡聚糖酶的动力学曲线。
硫酸铵沉淀性能优于乙醇：从粗提取液中回收总酶活单位的78.7%，酶活达156 U·g.d.s⁻¹；而乙醇在评估条件下导致显著酶活损失。沉淀提取物表现出高热稳定性，60°C孵育24 h后仍保留约92%的酶活。
讨论与解读
本研究证实了 Myceliophthora thermophila I-1D3b 在甘蔗渣与麦麸底物上、批式与连续操作的多层填充床反应器中固态发酵产内切葡聚糖酶的技术可行性与可重复性。连续操作降低了床内异质性，提升了各发酵模块间酶活均匀性，且未牺牲相对批式的平均产量。热剖面维持在物种最适范围附近——最大温度48.2°C（批式）与48.9°C（连续），表明连续操作未损害系统稳定性。浓缩策略中硫酸铵沉淀表现突出，回收率78.7%，酶活156 U·g.d.s⁻¹；乙醇在测试条件下导致净酶活损失。集成热控制、渗透提取与下游处理是平台鲁棒性与应用性的关键。未来研究应在中试规模验证并探索互补纯化路线。
编译者解读
该研究最值得关注的并非单一环节的优化，而是"生产—提取—浓缩"全链条在同一平台上的集成验证。连续操作将酶活变异系数从批式的近30%降至5%以内，这组数据远比均值对比更有说服力——工业酶制剂最忌批次间波动。硫酸铵沉淀78.7%的回收率与60°C下24 h保留92%酶活的热稳定性，为酶制剂的工业储运提供了现实基础。局限同样明显：中试放大尚未验证，乙醇沉淀的失败也提示有机溶剂路线在该体系中的适用性有限。从合成生物学视角看，若将底盘菌株的产酶谱与反应器的连续操作模式协同优化，或可进一步压缩单位酶成本。
参考来源
Mafra NSC, Casciatori FP. Integrated cellulase continuous production and downstream processing using a packed-bed bioreactor for solid-state fermentation by thermophilic fungus. Bioprocess Biosyst Eng. PMID: 42370983.
PMID: 42370983