来源：Sci Rep | 编译：DNA Lab Space
导读
纳米银（AgNPs）因其广谱抗菌活性在活性包装和伤口敷料领域备受关注，但传统物理化学合成法存在毒性高、能耗大等弊端。本研究从土耳其萨姆松省家庭自制醋中分离出5株醋杆菌（Acetobacter sp.）和1株驹形杆菌（Komagataeibacter sp.），利用其细菌纤维素生产过程中的液体废弃物作为反应介质，在3 mM硝酸银、50°C避光条件下成功实现AgNPs的可持续生物合成。研究系统表征了纳米颗粒的理化性质，评估了其抗氧化、抗菌、细胞毒性及食品包装应用潜力，为醋产业废弃物资源化利用提供了新路径。
研究背景
纳米技术已在医学、环境和农业领域引发革命性进展。纳米材料至少一维尺寸在1–100 nm之间，凭借小尺寸效应、高比表面积及与生物系统的特殊相互作用而备受关注。纳米银是目前应用最广泛的金属纳米颗粒之一，具有抗菌、抗炎、抗癌和抗氧化等多重特性，可用于伤口愈合材料、生物传感器、药物递送系统和食品包装等场景。
然而，金属纳米颗粒的物理和化学合成方法往往依赖有毒化学品、能耗高且产生环境有害废物。以“绿色合成”著称的生物合成方法，因利用环境友好试剂、产生较少有毒废物而日益受到重视。微生物被视为纳米颗粒合成的有效生物催化剂，能够将环境中的金属离子进行生物还原；同时，过程中产生的生物分子可作为天然稳定剂，减少颗粒聚集并提高稳定性。细菌合成纳米颗粒可通过胞内和胞外两种途径实现。
研究方法
细菌供应与保存
用于AgNPs生产的醋酸菌分离自家制醋，经鉴定为纤维素酶产生菌。菌株取自奥努库兹梅伊斯大学卡拉德尼兹先进技术研究与应用中心的−80 °C冻存库。细菌在Hestrin-Schramm（HS）琼脂培养基（5 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖、5 g/L蛋白胨、1.15 g/L柠檬酸、2.7 g/L Na₂PO₄、15 g/L琼脂）上培养以确认纯度。整个研究期间，细菌保存于4 °C。
AgNP生产的筛选
分离株在HS肉汤中于30 °C培养21天以进行细菌纤维素生产。培养结束后，小心去除培养液表面形成的纤维素膜。剩余培养液以10,000 × g离心10 min，随后过滤获得无细胞上清液。该上清液代表细菌纤维素生产过程中产生的液体废弃物，作为纳米银合成的反应介质。AgNP生产时，将培养上清液与AgNO₃溶液混合，使最终AgNO₃浓度为3 mM。反应混合物在50 °C避光孵育48 h。通过紫外-可见分光光度法监测表面等离子体共振（SPR）确认纳米银的形成。
基于16S rRNA基因的分离株鉴定
提取DNA用于醋酸菌表征，使用Genomic DNA Purification GeneJET Kit进行DNA分离。16S核糖体DNA片段经聚合酶链式反应（PCR）扩增，引物为27正向（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492反向（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'），按照试剂盒流程操作。反应使用Thermo Scientific DreamTaq DNA聚合酶。PCR混合物包含：4 µL基因组DNA、5 µL 10×缓冲液混合物、1 µL脱氧核苷三磷酸、各3 µL引物混合物、0.25 µL DreamTaq（Thermo Scientific）和33.75 µL无核酸酶水。反应程序为：95 °C初始变性3 min；随后40个循环：95 °C 30 s、55 °C 30 s、72 °C 1 min；最后72 °C延伸15 min。使用Genepro热循环仪（中国，Bioer Technology）TC-E-96G型号执行。
采用琼脂糖凝胶电泳在90 V下运行90 min评估PCR产物的大小和完整性。在含10 µL/mL EtBr的1%琼脂糖凝胶上，通过Chemidoc MP成像系统（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）观察DNA条带。PCR产物经分光光度法测定密度和纯度（A260/A280），使用SeqLine CleanSEQ Kit纯化，随后通过ABI 3130遗传分析仪（Applied Biosystems）进行双向测序。使用Chromas程序（Technelysium Pty. Ltd.）检查正反向引物获得的DNA序列质量，并通过BioEdit程序进行组装。将序列与EzBioCloud 16S数据库（https://www.ezbiocloud.net/）中的16S rRNA基因序列进行比较。最后，使用MEGA 6程序通过邻接法构建系统发育树。
AgNPs的生产与回收
首先，将AgNO₃加入从21天细菌培养物（HS肉汤，30 °C，150 rpm摇瓶条件）中经离心（10,000 × g，10 min）分离的上清液中，使终浓度为3 mM。反应混合物在50 °C避光孵育48 h，随后离心（13,000–15,000 × g，30 min）沉淀合成的AgNPs。AgNPs用超纯水洗涤，在无水烘箱中于50 °C干燥，最后避光保存备用。
AgNPs的理化表征
扫描电镜（SEM）与EDS mapping：微观结构表征
将适量AgNP粉末置于0.5 cm²玻璃载玻片上，使用JEOL JSM-7001F场发射扫描电镜（FESEM）在15 kV加速电压下分析样品。EDS mapping使用FESEM内置的X-Max 80 mm²检测器（Oxford Instruments，英国）在同一载玻片上进行。
衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）
干燥AgNPs的ATR-FTIR分析使用PerkinElmer Spectrum 100 FT-IR光谱仪（德国）在400–4000 cm⁻¹范围内进行，分辨率为4 cm⁻¹。分析前，合成的AgNPs经离心并用蒸馏水多次洗涤以去除未结合的生物分子和残留杂质，随后室温干燥。少量干燥的纳米颗粒粉末直接置于ATR晶体表面，无需进一步制备。光谱通过多次扫描平均记录以改善信噪比。所得光谱用于鉴定与AgNPs还原和稳定相关的生物分子官能团，重点分析O–H、C=O、C–O和N–H特征吸收带，以评估蛋白质、多糖或其他有机化合物在纳米颗粒合成和包覆中的参与。
X射线衍射（XRD）分析
采用Rigaku SmartLab衍射仪（Rigaku SmartLab Beijing Co.，中国）进行XRD分析，配备Cu Kα辐射（λ = 1.5406 Å）和Cu Kβ滤光片。粉末AgNP样品在分析前经干燥和细磨以确保均匀性。衍射图谱在2θ范围10–80°内以2°/min扫描速率记录，操作条件为40 kV和30 mA连续扫描模式。获得的衍射峰与标准粉末衍射联合委员会（JCPDS）数据比对，确认银的面心立方（FCC）晶体结构。对应（111）、（200）、（220）和（311）晶面的特征衍射峰用于验证结晶AgNPs的形成。此外，基于最强衍射峰的半高宽（FWHM），使用Debye–Scherrer方程估算平均晶粒尺寸。
动态光散射（DLS）与Zeta电位（ζ）
AgNPs在超纯水（折射率：1.330，粘度：0.8872）中的尺寸分布、平均直径和zeta电位使用Zetasizer Nano ZS（Malvern Panalytical，英国）在25 °C下分析。2 mL AgNPs悬浮液（1 mg/mL）置于石英比色皿中，经激光照射，通过散射光波动分析基于布朗运动测定颗粒尺寸。
抗菌活性分析
测试微生物包括蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌，这些微生物常与食品污染、腐败或食源性感染相关。革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌（ATCC 43300——耐甲氧西林）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923——甲氧西林敏感）、蜡样芽孢杆菌（NTCC 7464）、枯草芽孢杆菌（ATCC 6633）和粪肠球菌（ATCC 29212）。
研究结果
细菌供应、AgNP生产与表征
从萨姆松省家庭自制醋中分离的醋酸菌中，筛选出适合AgNP生产的菌株。反应混合物从浅黄色变为红棕色的视觉变化是判断适宜性的基础，UV-Vis光谱分析验证了这一变化。光谱中代表表面等离子体共振（SPR）振动的特征峰出现以及350–450 nm范围内的吸收峰确认了AgNPs的合成。如图1所示，苹果醋（1A、1B、3A）、无花果醋（2B、2D）和梨醋（X1）分离菌株的培养上清液均可合成AgNPs。
SPR峰的位置可推断AgNPs的理化特性——颗粒尺寸越小，SPR峰向短波长方向移动；悬浮液中纳米颗粒浓度越高，SPR峰强度越大。SPR光谱中吸收带的宽度反映粒径分布：宽谱带对应多尺寸分布，窄谱带则表明均一分布。据此判断，分离株1A、1B、3A和2D培养上清液合成的AgNPs粒径更小、分布更均匀，提示这些菌株的代谢物谱在纳米颗粒形成过程中能更有效地控制尺寸。所有合成AgNPs的浓度处于相近水平，说明尽管粒径和分布存在差异，各菌株的总纳米颗粒合成产量基本保持一致。培养上清液本身在纳米颗粒特征区域无显著吸收峰，AgNO₃溶液同样无SPR相关吸收。
分离株的16S rRNA基因序列经EzBioCloud平台分析与数据库记录比对。序列经比对后，使用邻接法构建系统发育树（图2）。分离株1A、1B、3A、2B和2D属于同一单系群，bootstrap值高（93–97%），与巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）、A. oryzoeni、A. ascendens和A. oryzifermentans等物种亲缘关系密切。基于核苷酸相似性，它们与巴氏醋杆菌系统发育关系最近。分离株X1则与驹形杆菌属物种聚类，与Komagataeibacter medellinensis和K. intermedius亲缘关系密切。菌株编号、属和GenBank登录号见表1，登录号（PV341489–PV341662）确认序列已提交至NCBI数据库。
表1 菌株编号、分离来源、菌种及NCBI登录号
| 菌株编号 | 分离来源 | 菌种 | 登录号 |
|---------|---------|------|--------|
| 1A | 苹果醋 | Acetobacter sp. | PV341489 |
| 1B | 苹果醋 | Acetobacter sp. | PV341624 |
| 2B | 无花果醋 | Acetobacter sp. | PV341496 |
| 2D | 无花果醋 | Acetobacter sp. | PV341505 |
| 3A | 苹果醋 | Acetobacter sp. | PV341506 |
| X1 | 梨醋 | Komagataeibacter sp. | PV341662 |
合成AgNPs的理化表征
AgNP的显微表征（电镜）结果
图3展示了从六株不同醋源分离菌株培养上清液合成的AgNPs SEM图像。SEM研究揭示了菌株特异性的纳米颗粒尺寸和分布差异，证实所有分离株的培养上清液均可生产AgNPs。Acetobacter sp. 1B、2D和3A培养上清液合成的AgNPs（A1B-AgNPs、A2D-AgNPs和A3A-AgNPs）直径分别为20–40 nm、30–60 nm和30–70 nm，且分布比其他纳米颗粒更均匀。Acetobacter sp. 1A和Komagataeibacter sp. X1培养上清液合成的AgNPs（A1A-AgNPs和KX1-AgNPs）呈球形，尺寸30–100 nm，但形态相对不规则。Acetobacter sp. 2B培养上清液合成的AgNPs（A2B-AgNPs）呈棒状并出现团聚现象。
表2中的EDS图谱显示AgNP结构具有相同组分。Ag占比46–93%，作为纳米银的主要成分符合预期。碳、氮、氧各占质量比最高20%，表面有机化合物的存在提示还原/包覆剂的作用。P、S和Cl（<4%）来自生物分子或合成环境。Na和Al以痕量存在，被认为是污染物或缓冲盐。已有研究表明，植物基合成中EDS可同时观察到Ag与高比例的C、N、O；银纳米颗粒周围的酚类包覆层在EDS中表现为C和O；蛋白质包覆的纳米银元素分析显示蛋白层特征性的氮和磷信号。SEM图像显示，AgNP表面最致密、最明亮的纳米颗粒分布……
讨论与解读
本研究利用醋杆菌生产细菌纤维素过程中产生的液体废弃物，建立了一种新颖且可持续的AgNPs绿色合成方法。合成的AgNPs经XRD、SEM和FTIR分析成功表征，确认了球形形貌和晶体结构。生物学评价显示，部分纳米颗粒变体（尤其是KX1-AgNPs和A2B-AgNPs）表现出抗氧化和抗菌活性，并显示出浓度依赖性的细胞毒性效应。随着基于AgNPs的活性包装系统日益普及，必须审慎考虑银离子或纳米颗粒向食品基质中迁移的潜在风险——部分研究表明这种迁移可能产生毒理学效应。未来研究须纳入全面的安全性评估，确保含AgNPs材料在食品接触应用中安全、负责任地使用。DLS和zeta电位分析进一步支持了生物合成纳米颗粒的功能稳定性和适用性，DLS测得的水合直径（85–179 nm）和PDI值（0.274–0.402）表明纳米颗粒群体呈中等单分散至异质分布。
编译者解读
该研究的亮点在于将醋产业废弃物“变废为宝”——利用细菌纤维素发酵废液同时实现纳米银的生物合成与天然稳定，契合循环经济理念。六株菌株产出的AgNPs在粒径、形貌和活性上呈现菌株依赖性差异，提示筛选高效菌株可定向调控纳米颗粒品质。KX1-AgNPs的DPPH清除率达56.01%、ESBL阳性大肠杆菌的最低抑菌浓度低至16 µg/mL，为其在活性食品包装中的应用提供了数据支撑。但需注意，银纳米颗粒的潜在迁移毒性仍是商业化应用的关键瓶颈，如何在抗菌效能与食品安全之间取得平衡，值得后续深入研究。
PMID: 42129258