来源：Microb Cell Fact | 编译：DNA Lab Space
碱性蛋白酶在食品、洗涤、皮革和制药等工业领域应用广泛，但其异源表达常因细胞毒性和分泌效率低下而受阻。华东理工大学的研究团队针对这一难题，将定向进化、机器学习辅助突变与信号肽工程三种策略整合起来，在毕赤酵母中实现了PrtA碱性蛋白酶的高效分泌表达。优化后的菌株在15升发酵罐中酶活达到4807.5 U/mL，相当于1.5 g/L蛋白产量，较野生型提升近5倍。
研究背景
微生物丝氨酸蛋白酶凭借广泛的底物特异性和良好的稳定性，在工业生物催化中占据重要地位。其中，PrtA是一种耐酸的碱性丝氨酸蛋白酶，在酸性环境下仍能保持活性，这一特性使其在特定工业场景中极具应用价值。
然而，将这类蛋白酶在微生物宿主中进行异源过表达并非易事。蛋白酶本身的细胞毒性会抑制宿主生长，而分泌效率低下则导致目标蛋白大量积累在胞内，难以获得高产量。毕赤酵母（Komagataella phaffii，又名Pichia pastoris）作为成熟的真核表达系统，具备蛋白质翻译后修饰能力和较强的分泌通路，但面对蛋白酶这类"棘手"蛋白，常规表达策略往往力不从心。
以往的研究多聚焦于单一策略——要么改造启动子，要么优化信号肽，要么进行突变筛选。但这些方法各自为战，效果有限。本研究的不同之处在于，将三种策略按序叠加，形成一条系统性的改造路径。从定向进化获得有益突变，到机器学习预测关键残基，再到信号肽的系统筛选，每一步都建立在上一阶段的基础上，最终实现效果的协同放大。
研究方法
菌株、质粒与培养基
研究使用E. coli Trans1-T1作为克隆宿主，K. phaffii GS115作为表达宿主。表达载体选用pPIC9和pPICZαA两种质粒。蛋白酶底物采用牛乳酪蛋白钠盐（C8654，购自Sigma-Aldrich）。限制性内切酶EcoRI、NotI和DraI购自Thermo Fisher Scientific。BMGY、BMMY、MD和MM培养基均按照EasySelect™ Pichia表达试剂盒（Invitrogen）说明书配制。
基因合成与质粒构建
编码PrtA丝氨酸蛋白酶（XP_663162）的基因按照毕赤酵母密码子偏好性进行优化，由华大基因合成。成熟PrtA编码片段通过特异性引物PrtA-MF和Prt-MR扩增，利用Basic Seamless Cloning and Assembly Kit（Transgen，北京）同源重组克隆至pPIC9质粒中，与α-factor信号肽形成框内融合，构建重组质粒pPIC9-prtA-M。测序验证插入序列正确性。
转化与蛋白表达
重组质粒经Bgl II限制性内切酶线性化后，电转化至K. phaffii GS115感受态细胞。蛋白表达按照EasySelect™ Pichia表达试剂盒说明书进行诱导。His⁺转化子先在MD琼脂平板和MM琼脂平板上30°C培养48小时进行初步筛选，用无菌牙签挑取单菌落进行后续验证。
定向进化与机器学习辅助突变
通过定向进化策略，研究团队获得Q245K突变体，其胞外表达量较野生型PrtA提高1.35倍。在此基础上，团队开发了机器学习模型MPEPE（Mutation Predictor for Enhanced Protein Expression），用于预测影响蛋白分泌的关键残基。模型输出排名靠前的位点被选作饱和突变靶点，由此获得I342D突变体，产量较野生型提升1.48倍。将两个有益突变叠加，构建双突变体PrtA-Q245K/I342D，其分泌量达到野生型的1.84倍，且酶学性质未发生改变。
信号肽筛选
研究系统评估了九种信号肽对双突变体分泌效率的影响。这九种信号肽包括血清白蛋白信号肽、α-factor（不含前导肽）、PrtA自身天然信号肽等。实验结果显示，血清白蛋白、α-factor（不含前导肽）和PrtA天然信号肽均能使双突变体的分泌量翻倍。值得注意的是，当α-factor前导肽被包含在构建体中时，产量急剧下降——这一结果提示前导肽的存在反而对PrtA的分泌产生了抑制作用。
15升发酵罐放大实验
在15升补料分批生物反应器中，优化后的菌株进行放大培养。最终发酵液酶活达到4807.5 U/mL，折合蛋白浓度1.5 g/L。这一数据验证了整套策略在工业规模下的可行性。
原文摘要未详述发酵过程中的具体参数（如温度、pH控制策略、甲醇诱导浓度、发酵周期等），也未提供SDS-PAGE或酶学性质表征的具体数据。
研究结果
定向进化获得首个有益突变
通过定向进化筛选，Q245K突变体展现出比野生型PrtA高1.35倍的胞外表达水平。这一结果说明，单个氨基酸残基的改变足以显著影响蛋白的分泌效率。Q245位于蛋白表面，推测其可能通过影响蛋白折叠中间态的稳定性或与分子伴侣的相互作用，间接促进了分泌通路的顺畅进行。
机器学习模型MPEPE精准预测突变位点
研究团队构建的MPEPE模型能够从序列特征中学习与蛋白分泌相关的规律，并给出影响分泌的关键残基排名。饱和突变实验验证了模型预测的准确性——排名首位的位点经突变后（I342D），产量提升至野生型的1.48倍。这一结果不仅验证了MPEPE的预测能力，也表明机器学习在指导蛋白工程改造方面具有实用价值。
双突变协同效应显著
将Q245K与I342D两个突变叠加，双突变体PrtA-Q245K/I342D的分泌量达到野生型的1.84倍，高于任一单突变体的效果。这种协同增强效应表明，两个突变可能作用于分泌通路的不同环节——Q245K可能改善蛋白折叠效率，I342D则可能增强蛋白穿越内质网或细胞壁的转运能力。更关键的是，双突变并未改变酶的催化性质，意味着工业应用所需的酶学特性得到了完整保留。
信号肽优化实现表达量倍增
九种信号肽的系统筛选揭示了信号肽选择对分泌效率的决定性影响。血清白蛋白信号肽、α-factor（不含前导肽）和PrtA天然信号肽均使双突变体的分泌量翻倍，三者效果相当。而α-factor前导肽的存在则导致产量急剧下降——这一对比鲜明地说明，信号肽的"完整程度"比预想中更为重要。
α-factor信号肽在毕赤酵母表达系统中被广泛使用，常规构建体往往保留其前导肽序列以促进蛋白易位。然而本研究的实验数据显示，对于PrtA而言，去除前导肽反而能大幅提升分泌效率。这一反直觉的发现提示，前导肽可能在某些蛋白的分泌过程中形成空间位阻或错误折叠中间体，阻碍蛋白顺利通过分泌通路。
组合策略实现4.98倍总提升
将最优突变组合与最优信号肽搭配，最终工程菌株的PrtA分泌量达到野生型的4.98倍。这一数值是单点突变效果（1.35倍）的三倍以上，充分体现了策略叠加的协同优势。
15升发酵罐验证工业可行性
在15升补料分批发酵中，优化菌株的酶活达到4807.5 U/mL，折合蛋白浓度1.5 g/L。这一产量水平对于蛋白酶类产品而言具有明确的工业吸引力。发酵规模从摇瓶到15升反应器的成功放大，也说明该策略的改造效果在规模化条件下没有出现明显衰减。
讨论与展望
这项研究的核心价值在于方法论层面的整合思维。定向进化、机器学习预测和信号肽筛选三者并非简单并列，而是形成了一条递进式的改造链条：定向进化提供有益突变起点，机器学习扩大突变搜索空间，信号肽工程解决蛋白跨膜转运瓶颈。每一步解决一个层面的问题，最终效果远超各策略单独使用的简单加和。
MPEPE模型的表现尤其值得关注。它仅凭序列特征就能预测影响分泌的关键残基，且预测位点经饱和突变验证确实有效。这意味着，未来面对新的目标蛋白时，研究人员可以跳过耗时费力的随机突变筛选，直接通过模型预测锁定少数高价值突变位点。这种"预测-验证"的工作模式，有望大幅缩短蛋白工程的改造周期。
α-factor前导肽的抑制作用也为信号肽选择提供了重要警示——并非所有毕赤酵母表达系统常用的分泌信号都适用于任何目标蛋白。针对特定蛋白进行信号肽的系统筛选，仍然是获得高分泌效率的必要步骤。
15升发酵罐的结果表明该策略具备工业放大的潜力。后续研究若能进一步优化发酵工艺参数（如甲醇诱导策略、pH控制、补料速率等），产量仍有提升空间。此外，该策略是否适用于其他"难表达"蛋白酶，也值得在更多蛋白体系中进行验证。
参考来源
Zhao B, Zhou Q, Wei P, Zhang H, Qin X. A combined strategy for high-efficiency expression of alkaline protease PrtA in Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris). Microb Cell Fact. PMID: 41808135.
PMID: 41808135