来源：Sustain Microbiol | 编译：DNA Lab Space
导读
生物燃料发酵中，酵母需要额外补充维生素和氮源等营养物质才能高效工作。本研究利用一种简易的毫升级发酵瓶系统，证明了光合蓝藻（Synechococcus sp. PCC 7002）的全细胞水解物可以作为酵母发酵小麦秸秆和云杉水解物的营养补充剂。添加经溶菌酶处理的高氮蓝藻生物质后，小麦秸秆水解物的乙醇初始产率从6.7 ± 0.2 g/L/天提升至18.7 ± 1.0 g/L/天，提高近三倍。该研究为木质纤维素生物燃料发酵提供了可持续的营养补充替代方案。
研究背景
为减少温室气体排放并以碳中和方式驱动交通系统，可持续替代化石燃料的方案成为迫切需求。生物精炼概念应运而生——将可再生资源加工为生物乙醇等先进燃料及其他可销售产品。与原油精炼不同，生物精炼依赖将不同类型生物质逐步精炼为其分子组分。植物、藻类和蓝藻通过光合作用将太阳能转化为化学能，储存在糖类、纤维素、木质素和油脂等多种生物分子中。
先进生物燃料基于多种非粮食作物，利用各类木质纤维素原料。然而，酵母对植物材料的发酵通常需要补充维生素和含氮化合物等营养素，以维持酵母代谢活性和生长。传统营养补充剂成本高且不可持续，寻找可再生的替代营养源成为提升生物燃料经济性的关键环节。
研究方法
小麦秸秆原料的制备
小麦秸秆（Triticum aestivum L.）在丹麦Skærbæk的Inbicon IBUS中试工厂进行水热处理。预处理第一步为水浸泡（80°C，5–10 min），随后物料进入反应器进行水热处理（195°C蒸汽注入，12 min），全程不添加化学品。收集于塑料袋中并储存于4°C的物料最终干重约为40% w/w。将商业纤维素酶制剂Cellic CTec2（Novozymes A/S，丹麦Bagsværd，活性为120 FPU/g）以22.8 mg/g干物质的剂量添加到预处理后的小麦秸秆中，同时加入Na-柠檬酸盐缓冲液（50 mM，pH 4.8）和水。混合物置于100 ml蓝盖瓶中，在轨道摇床（150 rpm）中于50°C水解4天（Jørgensen 2009）。所得水解物通过离心收集，液体和固体部分分离后储存于4°C。
发酵瓶系统的构建与验证
为开发一种简单、小体积的乙醇产量测定方法，我们设计并评估了小型发酵瓶的重量损失测量系统。在碳水化合物发酵生成乙醇的过程中，乙醇产量与CO₂产量相关，理想情况下摩尔比为1:1（见“材料与方法”部分）。因此，发酵系统因CO₂气体逸出而造成的重量损失可作为乙醇产量的度量指标。图1展示了该瓶设计——CO₂通过细针头释放，同时阻止O₂进入瓶内。我们观察到葡萄糖发酵试验中乙醇产量与瓶重量损失相关（图2A）。基于多次发酵实验（n = 77），我们发现了由CO₂损失测定的乙醇产量与HPLC分析测定的乙醇产量之间存在明确相关性（图2B）：线性回归斜率为1.132（95%置信区间：1.101至1.163），y截距为−0.222（95%置信区间：−0.765至0.321），决定系数R² = 0.987。结果清楚表明重量法测定的乙醇产量与HPLC测定结果之间存在线性相关，证实了重量法能可靠估算乙醇产量。
蓝藻生物质的制备
我们假设蓝藻生物质的氮含量对其作为酵母发酵营养补充剂的价值至关重要，因为蓝藻的高氮含量通常与高蛋白质及其他营养素含量相关（Forchhammer and Schwarz 2018）。在氮限制条件下，蓝藻会出现缺绿现象，此时细胞降解蛋白质、色素、核酸及其他细胞组分，C/N比显著升高。因此，为生产不同氮含量和营养组成的蓝藻生物质，Synechococcus分别在氮充足或氮限制条件下培养（图S1），分别生产高氮和低氮生物质。培养物在约65 h后收获，此时氮限制培养物已表现出缺绿现象。正如预期，低氮生物质的叶绿素和藻胆蛋白含量显著低于高氮生物质，而碳水化合物含量则更高（表1）。生物质在用于发酵试验前，按照“材料与方法”部分所述，采用酸水解或酶水解处理（表2）。选择这些处理方法是因为它们在生物质和细菌细胞降解中已有成熟应用。酸处理代表一种剧烈的方法，而溶菌酶处理则代表一种较温和的方法，推测比酸处理能更大程度地保留生物分子。
表1. 蓝藻生物质的组成
| 组分 | 高氮生物质（n = 2） | 低氮生物质（n = 4） |
|------|---------------------|---------------------|
| 碳水化合物（%干细胞质量） | 16 ± 1 | 44 ± 23 |
| 叶绿素（任意单位a） | 0.35 ± 0.01 | 0.18 ± 0.02 |
| 藻胆蛋白（任意单位a） | 0.28 ± 0.00 | 0.05 ± 0.03 |
a按Möllers等（2014）定义。
表2. 添加到酿酒酵母发酵中的蓝藻生物质补充剂概览
| 补充剂 | 蓝藻生物质a | 收获后处理a |
|--------|-------------|-------------|
| #a | 低氮 | 溶菌酶，37°C加50°C |
| #b | 低氮 | 溶菌酶，37°C |
| #c | 低氮 | 酸水解，100°C |
| #d | 高氮 | 溶菌酶，37°C加50°C |
| #e | 高氮 | 溶菌酶，37°C |
| #f | 高氮 | 酸水解，100°C |
a详见“材料与方法”部分。
研究结果
发酵系统的设置与可靠性
图1展示了用于乙醇产量测定的小型发酵瓶设置示意图。在发酵过程中，葡萄糖被酿酒酵母代谢为乙醇和CO₂。CO₂穿过针头逸出，导致瓶体出现可测量的重量损失，该损失与乙醇产量相关。针头同时限制O₂进入，从而维持厌氧条件。
图2验证了发酵系统设计。（A）在含有葡萄糖（40 g/L）的CBS培养基中，酿酒酵母发酵造成的瓶重量损失（空心圆和虚线）和计算所得乙醇产量（空心方块和实线）。乙醇产量根据瓶重量损失估算（见“材料与方法”部分）。同一发酵装置中HPLC测定的乙醇浓度也在三个时间点显示（黄色圆圈）。数值以平均值±标准差表示（n = 3）。（B）由CO₂损失计算的乙醇浓度与不同发酵实验HPLC分析测定的乙醇浓度之间的线性相关性（n = 77）。
蓝藻生物质的制备
我们假设蓝藻生物质的氮含量对其作为酵母发酵营养补充剂的价值很重要，因为蓝藻的高氮含量通常与高蛋白质和其他营养素含量相关（Forchhammer and Schwarz 2018）。在氮限制条件下，蓝藻表现出去绿化现象，期间细胞降解蛋白质、色素、核酸和其他细胞组分，并表现出显著升高的C/N比。因此，为生产具有不同氮含量和营养组成的蓝藻生物质，Synechococcus在氮充足或氮限制条件下培养（图S1），分别产生高氮和低氮生物质。培养物在约65 h后收获，此时氮限制培养物已表现出去绿化现象。正如预期，低氮生物质的叶绿素和藻胆蛋白含量显著降低，碳水化合物含量则高于高氮生物质（表1）。生物质在用于发酵试验之前，按照“材料与方法”部分所述，通过酸或酶水解处理（表2）。选择这些处理方式是因为它们在生物质和细菌细胞降解中的既有应用。酸处理代表一种剧烈的方法，而溶菌酶处理代表一种较温和的方法，推测比酸处理更大程度地保留生物分子。
葡萄糖发酵
为在最适发酵底物条件下测试酿酒酵母发酵系统，将含葡萄糖（40 g/L）的培养基分别补充不同预处理的高氮或低氮蓝藻生物质（0.5% w/v）（表1和表2）。图3A显示了96小时发酵时间进程实验，图3B显示了前24小时内测定的初始发酵速率。与不添加蓝藻生物质的对照（#g）相比，发酵速率提高最大的是经溶菌酶处理的高氮蓝藻生物质（#d和#e），产生了约3倍的提高。低氮（#a和#b）或酸处理的蓝藻生物质（#c和#f）对发酵速率的影响小得多。酸处理的低氮蓝藻生物质（#c）甚至导致发酵速率轻微下降，表明酸处理产生了抑制酵母的化合物。这些结果证实蓝藻生物质可作为酵母发酵的补充剂，增强葡萄糖的乙醇生产，且酶处理在营养动员方面优于酸处理。
小麦秸秆发酵
小麦秸秆是生物乙醇发酵的典型底物，添加酵母提取物等合成或复合营养素可改善其发酵性能（Jørgensen 2009）。为测试蓝藻生物质能否替代这些营养素，将小麦秸秆水解物分别补充不同预处理的高氮或低氮蓝藻生物质（0.5% w/v）（表1和表2），并进行酿酒酵母发酵。图3C提供了96小时发酵时间进程实验。与无补充剂的对照发酵#g相比，所有添加补充剂的发酵初始速率均有所提高，但发酵#c（低氮、酸处理）除外，其发酵曲线与对照几乎相同。补充剂#d和#e（高氮、溶菌酶处理）的发酵在48小时后分别达到75 mg和77 mg的最大CO₂损失，之后几乎没有增加，而补充剂#a和#b（低氮、溶菌酶处理）的发酵则需要72小时才达到最大CO₂损失。
云杉水解物发酵
为评估蓝藻生物质补充剂对其他木质纤维素底物的适用性，还对云杉水解物进行了发酵试验。在补充高氮、酶解蓝藻生物质（1.5% w/v）或与CBS培养基所用相同的维生素补充剂（见“材料与方法”部分）的条件下，监测了发酵过程中乙醇产量的时间进程。每种发酵条件进行三次生物学重复，图4显示了每次重复的乙醇产量。100%乙醇对应于葡萄糖转化为乙醇的完美化学计量转化。在不添加营养补充剂的条件下未观察到乙醇产生（未显示）。在CBS培养基中分别添加和不添加酵母接种物的发酵作为酵母活力的阳性对照和评估水分蒸发的阴性对照（未显示）。
讨论与解读
利用植物生物质和光合微生物生物质等可再生资源，是开发可持续工艺以减少温室气体排放的有前景策略。本研究证明，预处理的全细胞蓝藻生物质能显著增强酿酒酵母对木质纤维素底物的乙醇发酵。具体而言，经溶菌酶处理的高氮蓝藻水解物使小麦秸秆的乙醇产率提高约3倍，而酸水解生物质仅提高0.5倍。低氮蓝藻生物质无论采用何种预处理，对发酵的影响都极小。云杉水解物的发酵同样受益于蓝藻补充，尤其在缩短发酵迟滞期方面。
选择蓝藻制备营养补充剂，是因为这些生物的细胞壁容易被溶菌酶水解，从而允许相对温和的处理，能够保留并动员多种细胞组分（Möllers et al. 2014）。相比之下，微藻作为真核生物，具有多样且往往顽固的细胞壁结构，使细胞组分的降解和动员复杂化（Shivakumar et al. 2024）。研究还测试了酸处理——这是生物燃料发酵中常用的生物质动员方法，但该方法倾向于降解许多对生长有价值的生物分子。
编译者解读
本研究的方法学亮点在于用重量法替代HPLC进行乙醇定量，大幅降低了发酵筛选的实验门槛——一个针头、一台天平即可完成高通量营养源筛选。从合成生物学应用角度看，将蓝藻全细胞直接作为营养补充剂，省去了昂贵的提取纯化步骤，符合"以废促产"的循环经济理念。值得注意的是，溶菌酶温和处理显著优于酸处理，提示营养补充剂制备应优先考虑保留热敏性生物分子。局限在于蓝藻培养本身需要光能供给，其规模化经济性尚需全生命周期评估。未来若能将蓝藻培养与工业废气CO₂固定耦合，该策略的可持续性将进一步提升。
参考来源
Donati VL, Blossom BM, Cannella D, Frigaard NU. Whole-cell hydrolysate of cyanobacteria enhances biofuel fermentation of plant biomass. Sustainable Microbiology, 2025. PMID: 42576851.
PMID: 42576851