来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料的泛滥已构成全球性环境挑战，传统机械与化学回收难以兼顾效率与温和条件。生物酶解聚为塑料循环经济提供了绿色新路径，但天然酶活性低、热稳定性差，长期制约应用。近期，以理性设计、定向进化和机器学习为代表的酶工程策略密集涌现，在提升PET水解酶催化效率、耐热性和底物亲和力方面取得多项里程碑式进展。Groseclose与Nguyen在*Communications Materials*发表的系统综述，全面梳理了这些前沿策略，为酶法PET循环迈向工业化厘清了技术路线图。
研究背景
全球每年生产超过7000万吨PET，大量废弃塑料进入填埋场和海洋，微粒化后威胁生态系统。传统的机械回收伴随分子链降解，无法实现闭环；化学水解或醇解则需要高温（>200°C）、高压及强酸碱介质，能耗和二次污染严重。生物酶解聚因其反应条件温和（常温至70°C）、高度专一性和产物纯度高而备受关注，其核心在于利用酯键水解酶将PET大分子断裂为对苯二甲酸（TPA）和乙二醇（EG）等单体，可直接再聚合为新PET，实现“瓶到瓶”的无限循环。
然而，天然PET水解酶的催化效率远不能满足工业需求。早期发现的角质酶（如HiC、TfCut2）和脂酶在PET高结晶度区域几乎无活性；2016年从大阪堺菌中发现的IsPETase虽在常温下对低结晶PET有较好降解能力，但热稳定性极差（Tm≈48°C），在接近PET玻璃化转变温度（约70°C）时迅速失活。此后，叶分支堆肥角质酶（LCC）及其突变体因耐热性优越成为研究热点，但其对高结晶瓶片的解聚速度仍远低于化学法。因此，如何突破酶的“热稳定性–活性”权衡，以及对致密结晶区的攻击能力，是酶工程面对的核心科学问题。近年来，结构生物学、计算模拟和高通量筛选平台的交叉融合，使得针对PET水解酶的半理性与全理性设计成为可能，引发了该领域的爆发式增长。
研究方法
Groseclose与Nguyen的综述采用系统文献分析方法，检索了Web of Science、PubMed、Scopus等数据库中2010–2024年间的同行评议研究，重点关注PET水解酶的蛋白质工程改造。作者以“PETase”“PET hydrolase”“cutinase”“enzyme engineering”“directed evolution”“rational design”“machine learning”等为关键词组合，纳入原始研究、综述及预印本，优先选择具有结构表征、动力学参数和实物降解验证的研究。最终纳入120余篇文献，从酶源挖掘、突变设计、功能表征到工艺强化四个层次展开交叉对比。
在酶工程策略维度，作者将改良手段归纳为四类：
1. **定向进化**——通过易错PCR、DNA改组或体内连续进化，构建大容量突变文库，结合基于荧光底物或产物释放的高通量筛选，定位有益突变。例如基于荧光素标记PET纳米颗粒的筛选系统，能直接评估全酶对固相底物的活力。
2. **理性与非理性设计**——基于高分辨率X射线晶体结构或冷冻电镜结构，识别活性口袋、底物结合隧道和柔性环区，针对性引入二硫键、盐桥、脯氨酸铰链等稳定化基序，或扩宽催化通道以容纳更多PET链段。半理性设计则通过定点饱和突变靶向活性位点周边的“热点”位置。
3. **计算模拟辅助设计**——利用分子动力学（MD）模拟解析酶–底物结合构象的自由能图景，采用Rosetta、FoldX等软件进行自由能计算与突变扫描，再结合量子力学/分子力学（QM/MM）方法优化过渡态稳定化。深度突变扫描（deep mutational scanning）与机器学习（如MutaPLM蛋白质语言模型）通过从序列–功能空间学习突变效应，实现“零预实验”的高性能突变体推荐。
4. **模块化与协同设计**——将碳水化合物结合模块（CBM）、疏水肽段或锚定蛋白与水解酶融合，增强对PET疏水表面的亲和力；将PETase与中间产物水解酶MHETase组成融合蛋白或共表达系统，解除单（2-羟乙基）对苯二甲酸（MHET）的产物抑制，加速TPA终产物的释放。
此外，为弥合基础研究与工业应用的鸿沟，综述还归纳了工艺层面的强化策略，包括碱性缓冲体系下的酶解、温控分段反应、产物原位沉淀、酶固定化及连续流膜反应器等，以考察酶改造体在实际预处理PET瓶片和废弃纺织品上的表现。
研究结果
综述揭示，单一突变已无法满足工业需求，多维度协同改造才是突破瓶颈的关键。最具标杆意义的是LCC的ICCG变体（F243I/D238C/S283C/Y127G），通过引入二硫键（D238C/S283C）锁定活性位点附近的柔性环，同时以F243I增加疏水界面面积、Y127G消除空间位阻，使得Tm值提高至94.8°C，在72°C下对无定形PET薄膜的解聚率72小时内超过90%，较野生型LCC活性提升约3个数量级。进一步引入CBM或建立谷氨酸棒杆菌分泌表达体系，使高结晶瓶片的降解率达到60%以上。
在常温水解酶方面，基于IsPETase的理性设计取得突破。FAST-PETase工程体通过计算稳定化设计，引入N233K、R224Q、S121E等突变，在30–50°C的温和条件下即可高效解构未经预处理的商业PET瓶片，生成大量TPA和MHET。其巧妙之处在于，在保持活性位点柔性的同时，通过表面电荷优化和氢键网络重排，使酶整体刚性适度增强而不牺牲催化构象变化。另一支基于嗜热酶ThermoPETase的进化体在60°C下活性比IsPETase提升逾百倍，表明嗜热祖先重构是获得坚实骨架的有效路径。
机器学习赋予的突变预测能力令人瞩目。MutaPLM等蛋白质语言模型在IsPETase数据集上成功推荐出多个此前未被表征的稳定化突变，使变体的半衰期延长3–8倍而不损害活性。深度突变扫描结合高通量荧光激活液滴分选，更一次性定位出活性提升20倍的ThcCut2角质酶突变体。协同酶系的研究显示，单独PETase水解产生的MHET会强效回馈抑制，而融合MHETase或构建双酶空间邻近的支架体系，可将终产物TPA产率提高至理论值的95%以上。此外，碱性适应型变体（如引入Arg/Lys表面簇）在高pH环境下依然保持高活力，适合于与碱预处理或原位碱解耦合的新工艺。
讨论与展望
所述的酶工程进展已将PET生物解聚的催化效率推进到接近或达到工业门槛的水平，但仍存在若干关键挑战。第一，当前多数酶仍对高结晶度（>30%）、高取向度的PET（如吹塑瓶体）降解缓慢，需结合有效的物理或溶剂预处理以暴露可及链段，这不仅增加成本，还会带来溶剂回收问题。第二，酶在高固含量（10–20 wt%）体系中的传质限制和机械失活尚需解决，反应工程上需开发低剪切搅拌与新型气升式生物反应器。第三，胞外分泌表达水平仍偏低，全局优化的细胞工厂构建和大规模发酵成本需进一步降低才有望与化学法竞争。
未来，计算与自动化实验闭环（self-driving lab）的深度融合，有望大幅加速“设计–构建–测试–学习”循环，甚至实现无需人为干预的超高通量定向进化。蛋白质语言模型将从已知PET酶序列中学习进化约束，拓展到全新宏基因组来源的酶骨架设计。同时，以低值PET废弃物为唯一碳源的微生物混菌体系可将解聚与单体转化偶联，直接合成高值化学品如PHA、香兰素。最终，酶法PET循环将与城市矿产、分布式微工厂概念结合，构建真正的地域化、碳中和型塑料闭环经济。
**参考来源**
Groseclose T M, Nguyen H B. Recent advances in enzyme engineering for improved deconstruction of poly(ethylene terephthalate) (PET) plastics. *Communications Materials*, 2025, DOI: 10.1038/s43246-025-00919-8.
DOI: 10.1038/s43246-025-00919-8