大麦赤霉病多组学分析揭示病原菌

📅 2026-08-12 📰 Stress Biol 2026 Jun 1 📂 研究进展 👁 17

来源：Stress Biol | 编译：DNA Lab Space

导读

赤霉病（FHB）由镰刀菌属真菌引起，严重威胁大麦和小麦等谷类作物的产量与品质。本研究整合转录组学、蛋白质组学与代谢组学，系统解析了大麦穗部对黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）侵染的防御反应。研究发现，色氨酸衍生的应激代谢物（如色胺、血清素）及大麦特有的羟基肉桂酰胺类化合物在转录、蛋白和代谢物三个层面均呈现一致性上调，表明芳香族氨基酸衍生的次生代谢是大麦抵御赤霉病的核心响应途径。

研究背景

赤霉病是影响小粒谷类作物的毁灭性真菌病害，欧洲小麦和大麦的主要病原为禾谷镰刀菌（F. graminearum）和黄色镰刀菌（F. culmorum）。该土传病原菌在宿主花期通过开放的花器侵染，先进行生物营养生长，约48小时后转为死体营养生长，导致穗部褐变枯萎。镰刀菌产生多种真菌毒素，其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）通过结合真核核糖体肽基转移酶中心抑制蛋白质生物合成，对人类和动物健康构成威胁。与大麦不同，小麦缺乏天然的抗性。大麦具有天然的II型抗性，能够阻止真菌在穗轴中的扩散，但不同品种间的抗性水平存在差异。此前研究多聚焦于转录水平的防御反应，尚不清楚这些反应在蛋白质和代谢物层面的转化程度。本研究通过多组学整合策略，探究大麦对黄色镰刀菌侵染的防御机制。

研究方法

感染实验

温室实验包含四个对赤霉病敏感性不同的大麦基因型：Barke、Avalon、Morex和Palmella Blue。植株在慕尼黑工业大学植物技术中心的温室隔间内、漫灌台上受控条件下生长。使用3升盆钵装泥炭基质（Einheitserde C700，Stender，德国），每盆播种5粒种子，昼夜温度为18/16°C，每日补充光照16小时，相对空气湿度60%。

人工接种使用来自慕尼黑工业大学植物病理学讲席真菌培养物保藏中心的三个黄色镰刀菌分离株Fc002、Fc03和Fc06。真菌在马铃薯葡萄糖琼脂上于21°C、60%相对湿度、12小时紫外加白光与黑暗交替循环条件下培养。孢子悬浮液以无菌自来水配制，含1 ml/l Tween 80®，调整孢子浓度为50,000分生孢子/ml，三个菌株各等量混合。对照处理（Mock）为含1 ml/l Tween 80的无菌自来水。

大麦穗部在盛花期（GS 65）前后喷雾接种黄色镰刀菌孢子悬浮液或对照溶液至滴流，随后用塑料袋包裹密封2天以确保99%的相对空气湿度。接种后4天和7天取样，立即用液氮冷冻。每个品种、处理和时间点收集4个重复，每个重复由3个穗混合而成。

DNA提取

穗组织在液氮中研磨，取150 mg样品按Fraaije等（1999）方法并参照Hofer等（2016）的修改方案提取基因组DNA。

真菌DNA定量

通过qPCR测定未成熟穗组织中真菌DNA与大麦基因组DNA的相对含量，使用靶向延伸因子1α（EF1α）的种特异性引物。黄色镰刀菌引物：FculC561正向，CACCGTCATTGGTATGTTGTCACT；Fcul614反向，CGGGAGCGTCTGATAGTCG。大麦引物：Hor1正向，TCTCTGGGTTTGAGGGTGAC；Hor2反向，GGCCCTTGTACCAGTCAAGGT。以靶标DNA的十倍稀释系列作为标准品。使用Takyon Low ROX SYBR 2X MasterMix Blue dTTP（Eurogentec，比利时）在AriaMx实时PCR系统（Agilent Technologies）上进行两个技术重复的测量。

RNA提取

穗材料在液氮中研磨，取每份样品100 mg，使用GeneMATRIX Universal RNA Purification Kit（EURx Molecular Biology Products）按制造商说明书提取总RNA。

3'-RNA测序

使用QuantSeq 3'mRNA-Seq Library Prep Kit（Lexogen，奥地利）按制造商说明书制备3'-RNA测序文库。文库大小用Qubit荧光计2.0和Qubit DNA High Sensitivity Assay Kit定量，cDNA文库的可行上机混合池用qPCR确定。使用Agilent 2010电泳生物分析仪配High Sensitivity DNA Assay检查每个文库的完整性和mRNA片段大小分布。下一代测序在Illumina NovaSeq 6000系统上进行。

3'RNAseq读段质量检查、比对与注释

获得的3'RNAseq读段使用nf-core/rnaseq（v3.17.0）配合Nextflow（v24.04.4）处理。比对使用已发表的Morex V3参考基因组（Mascher等，2021）与黄色镰刀菌基因组FusCulm_01（GenBank提交号GCA_003033665.1）的合并版本，最后一个外显子的3'-UTR区域延伸3 kb或延伸至下一个基因。使用STAR（v2.11.7b）进行读段比对，Salmon（v1.10.3）进行转录本定量，FastQC（v0.12.1）进行原始读段质量控制，Trim Galore（v0.6.10）配合Cutadapt（v4.9）进行接头修剪和过滤。原始读段和比对数据已提交至GEO，项目编号GSE310570。

差异基因表达分析

差异基因表达分析使用edgeR包版本4.0.16。比对的镰刀菌基因从后续分析中排除。低表达基因通过保留至少4个样品中CPM > 10的基因进行过滤。数据集随后通过calcNormFactors()进行TMM标准化。使用model.matrix()构建设计矩阵以定义样品分组。使用estimateDisp()进行稳健的离散度估计。使用glmFit()拟合广义线性模型（GLM），并使用makeContrasts(genotype_infected_4dpi – genotype_mock_4dpi; genotype_infected_7dpi – genotype_mock_7dpi)定义条件与基因型之间的特定对比，以进行差异表达分析。

蛋白质提取与样品制备

从每份样品500 mg中提取蛋白质，采用三氯乙酸/丙酮沉淀后进行酚提取，方法参照Brajkovic等（2023）。蛋白质通过二喹啉甲酸测定法（BCA，Thermo Pierce）定量。200 µg蛋白质裂解液在Bravo Agilent移液系统上使用Sera-Mag™羧酸盐修饰磁珠（Cytiva Europe GmbH，德国弗莱堡）进行蛋白聚集捕获后胰蛋白酶消化。

定量蛋白质组学测量中，样品分为8个批次，每批包含一个基因型在接种后4天或7天的样品。每批含8个样品和一个以混合样品作为运行间校准器的参考通道。消化后的肽段用每份样品0.1 mg TMT10plex™等压质量标签标记试剂（Thermo Scientific™）标记，并按批次设计合并。标记并合并的样品用C18 Sep-Pak柱（37–55 µm粒径，50 mg容量，Waters）脱盐，洗涤步骤使用0.1%甲酸。肽段在含0.1%甲酸的60%乙腈中洗脱。洗脱的肽段冷冻干燥后于−20°C保存。

离线碱性反相分级

肽段的反相（bRP）分级参照Höfer等（2025）的方法进行。干燥的肽段溶于200 µl 25 mM碳酸氢铵（pH 8.0）。使用Vanquish HPLC（Thermo Scientific）进行分级。样品注入Waters BEH130 XBridge C18柱（3.5 µm，4.6 × 250 mm）。肽段用60分钟梯度洗脱，乙腈从7%升至45%，恒定存在2.5 mM碳酸氢铵（pH 8.0），流速1000 µl/min。注射后7至55分钟期间用自动级分收集器收集级分。所得96个级分用1%甲酸酸化并合并为48个级分，冷冻干燥后于−20°C保存。

LC–MS/MS测量

全蛋白质组TMT肽段用Eclipse Tribrid质谱仪（Thermo Scientific）测量，该仪器与Vanquish Neo（Thermo Scientific）联用。样品直接注入Acclaim PepMap 100 C18柱（2 µm粒径，1 mm内径×150 mm）。分离在27分钟分段梯度上进行，流速50 µl/min，从4% B升至27% B（23分钟），再升至32% B（2分钟）。系统最后用100 µl 90% B洗涤并在1% B下重新平衡。溶剂A为含0.1%v FA和3%v DMSO的水。溶剂B为含0.1%v FA和3%v DMSO的乙腈。质谱仪以快速、数据依赖的MS3模式运行。喷雾电压设为3.5 kV，辅以鞘气（32单位）和辅助气（5单位），蒸发器温度125°C。每1.2秒进行一次全扫描。

研究结果

黄色镰刀菌感染大麦中转录本与蛋白质的比较

为鉴定大麦防御黄色镰刀菌的代谢通路，本研究检测了穗组织感染后的基因表达、蛋白质丰度和代谢物产生变化。四个大麦基因型——Avalon、Barke、Morex和Palmella Blue——在受控温室条件下生长。这些品种均具有II型赤霉病抗性（阻止真菌通过穗轴扩散），但对穗部小穗初始感染的I型抗性水平不同，与先前田间或温室观察一致。Avalon（Av）和Barke（Ba）为较抗病品种，Palmella Blue（Pb）较感病，Morex（Mo）为中度感病。盛花期前后，植株穗部用黄色镰刀菌孢子悬浮液或水（对照处理）处理。接种后4天和7天分别取样。

通过qPCR定量真菌DNA与大麦DNA的相对含量来评估病害严重程度和侵染成功率。真菌DNA含量随取样时间点延长而增加，且在不同大麦品种间存在差异。Avalon和Barke表现出相近的低感染水平，接种后7天真菌DNA含量分别为4.39和5.56 pg Fcul DNA/ng Hv DNA。Morex同期含量较高，为9.63 pg Fcul DNA/ng Hv DNA，Palmella Blue的真菌DNA含量最高（22.38 pg Fcul DNA/ng Hv DNA）（表1）。真菌DNA载量反映了先前报道的这些品种定量抗性差异。但需注意，由于花期不同，并非所有品种能同时接种，而是分两批进行——Avalon和Barke为第一批，Morex和Palmella Blue为第二批。因此四个品种间的可比性部分受限，尽管数据反映了基因型典型的病程进展。

表1 四个品种接种黄色镰刀菌孢子悬浮液后4天和7天（dpi）穗组织的真菌DNA含量（qPCR检测）

|------|--------|-------|-------|---------------|

| 4 dpi | 2.04 ± 1.15 | 2.39 ± 1.01 | 0.95 ± 0.60 | 1.23 ± 1.26 |

| 7 dpi | 4.39 ± 1.29 | 5.56 ± 1.58 | 9.63 ± 5.06 | 22.38 ± 10.32 |

单位为pg Fcul DNA/ng Hv DNA ± SD

为分析黄色镰刀菌感染后大麦穗组织的基因表达变化，本研究进行了3'-RNA测序。将RNA读段比对至Morex-V3参考基因组，在四个品种中共检测到36,920个基因模型的RNA转录本。将感染样品的读段计数与相应基因型和时间点的对照样品比较，以寻找差异表达基因（DEGs）。在至少一个比较中FDR校正P值<0.05的基因被认定为DEG。数据集中共获得3085个DEGs。其中1205个DEGs在非靶向蛋白质组学分析中检测到相应肽段（见下文；图1A）。四个品种的DEG数量不同，Avalon、Palmella Blue和Barke各约1700个，而Morex有942个基因转录本在感染后差异表达。四个品种共有685个DEGs。

▲ A Integrated analysis of gene transcript and protein abundances in barley spikes following Fusarium culmorum infection. Transcriptomic profiling was performed using 3′-RNA sequencing, with reads mapped to the Morex V3 reference genome, resulting in 36,920 reliably detected gene models. Differential

为分析感染后蛋白质丰度变化，本研究采用非靶向自下而上蛋白质组学方法，包括Tandem Mass-Tag（TMT）标记以实现蛋白质的相对定量。肽段比对和蛋白质鉴定在MaxQuant中进行，使用基于Morex v3基因组的蛋白质预测。这产生了6885个定量蛋白质组，包含7671个蛋白质。将感染与对照样品之间的标准化相对丰度进行比较，计算蛋白质丰度的倍数变化。在至少一个比较中p值<0.05的蛋白质被认定为差异丰度蛋白（DEPs）。数据集包含2813个DEP组，含3169个蛋白质（图1A），其中1405个为Palmella Blue特有，Avalon和Barke特有DEP分别为591和345个。四个基因型共有的DEP为83个。在所有定量蛋白质和比较中，色氨酸脱羧酶在黄色镰刀菌感染后通常表现出最高的丰度增加。其他显著上调的蛋白质包括病程相关蛋白、糖基转移酶和谷胱甘肽-S-转移酶，这些通常与植物对镰刀菌和DON的防御反应相关。

转录组学和蛋白质组学数据集的重叠包含7149个基因/蛋白质对，这些对同时鉴定到转录本并定量到相应蛋白质。为寻找最可靠参与防御反应的基因和蛋白质，定义了570个DEG/DEP基因-蛋白质对，这些对在基因表达和蛋白质丰度两个层面均显示差异调控（图1A）。

代谢组学分析

（此处原文未详述代谢组学具体方法步骤，仅在图2中呈现结果）

▲ Differential abundance of metabolic features in barley cultivar Avalon at seven days post inoculation with F. culmorum spore solution in comparison with mock-treated controls. Inoculation was performed around mid-anthesis. Infected samples were compared with mock-treated controls of the same cultiva

莽草酸途径

▲ A Schematic overview of the shikimate pathway. Enzymes that are part of the 570 differentially expressed gene/protein (DEG/DEP) pairs are shown in bold. Fold changes are considered significant at a FDR-corrected P -value < 0.05. B Differential expression of shikimate pathway gene transcripts and

色氨酸与褪黑素生物合成途径

▲ A Schematic overview of the tryptophan biosynthesis and melatonin biosynthesis pathways. Enzymes that are part of the 570 differentially expressed gene/protein (DEG/DEP) pairs are shown in bold. Fold changes are considered significant at a FDR-corrected P -value < 0.05. B Differential expression

苯丙氨酸、木质素单体和燕麦碱生物合成途径

▲ 图1：苯丙氨酸生物合成、单木质醇生物合成和禾草碱生物合成途径的概览。570个差异表达基因/蛋白（DEG/DEP）对中涉及的酶以粗体显示。倍数变化以FDR校正P值<0.05为显著。图2：接种禾谷镰孢菌孢子溶液后，大麦穗中苯丙氨酸、单木质醇和禾草碱生物合成途径基因转录本和蛋白的差异表达，与模拟处理对照组比较。热图显示基因转录本的log₂（倍数变化）值。

讨论与解读

本研究整合三种非靶向组学方法，深入分析了大麦对半活体营养型病原菌黄色镰刀菌的防御反应。数据集在转录本和蛋白质水平上提供了大麦-镰刀菌互作的全面视图。单一组学研究可能无法展示病原防御通路的完整图景，或存在方法学偏差。相比之下，来自同一植物材料的基因表达、蛋白质丰度和代谢物水平的比较，鉴定出在所有分子水平上一致上调的通路。尽管品种的基础赤霉病抗性不同，但它们都具有大麦典型的II型抗性，阻止真菌通过穗轴扩散。因此推测，共同上调的通路可能有助于大麦对赤霉病的II型抗性。

黄色镰刀菌感染导致大麦基因调控和蛋白质组重塑。在至少一个大麦品种的4和/或7 dpi时鉴定出36,920个基因转录本，包括3085个DEGs。此外，定量了7671个大麦蛋白质，其中3169个在赤霉病感染期间表现出显著差异丰度。为聚焦一致调控的病原响应通路，定义了570个DEG/DEP基因-蛋白质对，这些对同时显示差异基因表达和差异蛋白质丰度。

编译者解读

该研究的方法学亮点在于同一植物材料上同时进行三层组学分析，避免了跨批次样品的生物学变异。570个DEG/DEP对的定义策略有效过滤了单一层面的噪声，突出了真正在转录-蛋白层面协同响应的核心通路。色氨酸脱羧酶作为感染后丰度增幅最大的蛋白质，与色胺、血清素等代谢物的积累相呼应，提示芳香族氨基酸代谢是大麦化学防御的枢纽。从合成生物学应用角度看，这些鉴定的关键酶（如糖基转移酶、羟肉桂酰胺合成酶）可作为异源重构抗菌代谢通路的候选基因。不过，四个品种分两批接种的设计在一定程度上限制了品种间直接比较的严谨性，真菌DNA定量也显示Palmella Blue的感染水平变异较大——这提示后续研究或需在更严格同步的实验设计中验证这些通路的普适性。

参考来源

Hein S, Steidele CE, Hoheneder F, Brajkovic S, Kuster B. Multi-omics of barley Fusarium Head Blight converge on pathogen-triggered biosynthesis of aromatic amino acid derived chemical defense compounds. Stress Biol. PMID: 42223798. DOI: 10.1007/s44154-026-00313-5.

PMID: 42223798

延伸阅读：更多代谢通路设计、多基因组装等合成生物学工具，可访问 DNA Lab Space。