来源：ACS Omega | 编译：DNA Lab Space
天然产物的化学多样性是药物筛选的源头活水，但如何高效地制造“非天然”的分子多样性，一直是化学生物学领域的核心议题。瑞士日内瓦大学的研究团队近日在《ACS Omega》上发表了一项研究，利用来自变色栓菌（Trametes versicolor）的漆酶，对二氢芪类化合物gigantol以及两种菲类化合物flavidin和coelonine进行生物转化，成功分离出13个结构多样的衍生物，其中10个为全新化合物。这项研究展示了一条绿色、高效的天然产物结构多样化路径。
研究背景
天然产物长期以来一直是药物发现的重要来源，其复杂的骨架结构和多样的官能团为药物设计提供了丰富的灵感。然而，从自然界直接获取的化合物往往数量有限，且结构相对固定，难以满足大规模生物活性筛选的需求。化学合成虽然能够改造天然产物结构，但常涉及多步反应、有毒试剂和苛刻条件，与绿色化学理念相悖。
生物转化利用酶或整细胞作为催化剂，在温和条件下实现结构修饰，被视为一种环境友好的替代方案。漆酶（laccase）是一类含铜的多酚氧化酶，能够催化酚类底物的单电子氧化，生成活性自由基中间体，进而引发分子间的偶联反应。已有研究表明，漆酶介导的转化可在多种化学类别中产生具有生物活性的化合物。然而，将其系统应用于二氢芪类和菲类骨架——这两类在兰科植物中常见且具有抗炎、抗肿瘤活性的天然产物——的研究尚不充分。
研究方法
材料与试剂。 研究选用了三种底物：gigantol（1，CAS: 83088-28-2，购自法国Extrasynthese公司）、flavidin（2，CAS: 83924-98-5）和coelonin（3，CAS: 82344-82-9，均购自中国湖北ChemFaces公司）。漆酶来自变色栓菌（CAS: 80498-15-3），购自德国Merck公司。实验所用有机溶剂均为分析纯或色谱纯级别。
分析平台。 紫外光谱在HACH UV-vis DR/4000仪器上测定。核磁共振（NMR）数据由配备QCI 5 mm低温探针和SampleJet自动进样器的Bruker Avance Neo 600 MHz核磁共振波谱仪采集。化学位移以残留的DMSO-d₆信号（δH 2.50；δC 39.5）为内标，分别以ppm为单位报告¹H和¹³C NMR数据，耦合常数J以Hz为单位。结构确证基于二维NMR实验（COSY、ROESY、HSQC和HMBC）的完整归属。
分析规模生物转化反应。 反应在2 mL Eppendorf管中进行，每管仅转化一种底物。反应总体积为0.5 mL，底物以乙醇溶解，终浓度为1 mg/mL，即每管含500 μg底物。漆酶最后加入，用量为30 μL、浓度12.5 U/mL的水溶液。反应体系设计为含10%乙醇、最高60%丙酮、30%至90%水（v/v）。配制完成后，混合物置于室温、避光条件下，持续温和振荡。反应3至9小时后，用500 μL乙酸乙酯萃取反应介质。有机相经氮气流干燥，最终溶于200 μL甲醇，通过超高效液相色谱（UHPLC）进行分析。
条件优化与放大。 为考察底物在不同条件下的反应活性，研究人员进行了小规模生物转化实验，底物用量500 μg，反应体积0.5 mL，并用UHPLC-PDA-ELSD-MS实时监测（见原文Supporting Information Figure S1）。研究中测试了不同有机溶剂浓度（10%至70%）和漆酶浓度（10至100 U/mL储备液）。最优条件以底物信号显著减弱和MS基峰强度（BPI）色谱图中出现多个新峰为判断标准。放大反应采用20至50 mg底物，反应体积5至10 mL，监测条件与分析规模一致。待底物消耗完全后终止反应，对粗混合物进行纯化。
产物纯化与结构鉴定。 优化并放大生物转化反应后，粗混合物通过高分辨率半制备高效液相色谱（semipreparative HPLC）进行纯化，采用干法上样（dry-load injection）技术。所有分离得到的产物均通过高分辨质谱（HRMS）和核磁共振波谱（NMR）进行全面表征。
研究结果
gigantol（1）的生物转化。 在评估的多种条件中，以30%有机溶剂、30 μL浓度12.5 U/mL的漆酶溶液、室温孵育9小时为最优条件，产生了大量MS信号。质谱分析显示，这些信号对应羟基化衍生物（m/z 291 [M+H]⁺）、乙基化衍生物（m/z 319 [M+H]⁺）以及gigantol的二聚体（m/z 545–549 [M+H]⁺）。主要化合物4和5在多种条件下均稳定出现，另有其他次要衍生物6至9同时生成。值得注意的是，gigantol在整个过程中从未被完全转化，始终有部分底物残留。当缩短孵育时间并提高漆酶浓度时，获得了额外的非典型衍生物12和13，但代价是一些次要衍生物的产率下降。
flavidin（2）与coelonin（3）的生物转化。 两种菲类底物同样在漆酶催化下发生转化。反应条件与gigantol类似，但具体参数（有机溶剂比例、酶浓度、孵育时间）根据底物特性进行了调整。UHPLC-MS监测显示，两种底物均被消耗并产生多个新峰，表明转化过程顺利。
分离与结构解析。 通过上述工作流程，研究团队成功分离出13个结构多样的衍生物。经HRMS和NMR综合表征，其中10个化合物为首次报道的全新结构。这些衍生物包括单体、二聚体和三聚体——不同聚合程度的产物反映了漆酶催化下自由基偶联反应的多样性。二聚体和三聚体的形成尤为引人注目，表明漆酶氧化产生的自由基中间体能够发生分子间的C-C或C-O偶联，从而构建更为复杂的多环骨架。
转化产物的结构特征。 质谱数据揭示了多种修饰模式：羟基化（m/z 291 [M+H]⁺对应gigantol单羟基化产物）、乙基化（m/z 319 [M+H]⁺）以及二聚化（m/z 545–549 [M+H]⁺）。这些修饰显著增加了底物的结构复杂性。NMR分析进一步确定了各衍生物的精确结构，包括官能团的位置和立体化学信息。新化合物的发现丰富了二氢芪类和菲类天然产物的结构库，为后续生物活性筛选提供了物质基础。
讨论与展望
这项研究的核心价值在于方法学层面。漆酶介导的生物转化在室温、水相条件下即可完成，避免了传统化学合成中的有毒试剂和多步操作。三种底物在相同酶催化下均能高效转化，且产物涵盖单体、二聚体和三聚体，展示了漆酶作为“分子剪刀”和“分子胶水”的双重功能——既能引入羟基、乙基等官能团，又能催化分子间偶联。
10个新化合物的发现尤其值得关注。菲类和三聚体骨架在天然产物中并不常见，这些新结构可能具有独特的生物活性空间。原文摘要未详述各化合物的具体生物活性数据，但研究明确指出了这些新骨架在生物筛选活动中的潜在价值。
一个值得思考的问题是：gigantol在最优条件下也从未被完全转化，这是否意味着反应存在某种平衡限制？研究团队通过调整孵育时间和酶浓度获得了额外产物，暗示精细调控反应参数可以定向改变产物谱。未来若能进一步解析漆酶催化不同底物的动力学差异，或通过蛋白质工程改造酶的选择性，这一策略有望成为天然产物结构多样化的通用平台。就目前而言，这项研究为利用真菌漆酶制备结构新颖的天然产物衍生物提供了扎实的方法学参考。
PMID: 42495288