来源：J Anim Sci Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导读
L-异亮氨酸是畜禽必需的支链氨基酸，参与蛋白质沉积、能量代谢与免疫调控。本研究整合生物传感器辅助ARTP诱变、结构引导蛋白工程与模块化途径重排，系统改造谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），最终菌株cgl-Ile8在5-L发酵罐中产量达48.49 g/L，放大至50-L后进一步提升至50.12 g/L，为目前报道的谷氨酸棒杆菌L-异亮氨酸最高产量。
研究背景
L-异亮氨酸是畜禽必需支链氨基酸，支持蛋白质沉积并调节能量代谢、免疫功能及应激抵抗力。当前工业生产中，谷氨酸棒杆菌是公认安全（GRAS）的氨基酸生产宿主，但L-异亮氨酸的合成受限于途径瓶颈酶的反馈抑制、前体供应不足及辅因子不平衡等瓶颈。本研究旨在通过系统代谢工程策略，整合多种工程手段构建高效生产L-异亮氨酸的工业菌株。
研究方法
菌株、质粒与引物
本研究所用全部菌株、质粒及引物列于附表S1和S8。基因组整合位点、异源基因、遗传工程靶点及用于途径构建的启动子组汇总于补充表S2–S7。以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株进行随机诱变以产生生产候选菌株，从中筛选获得L-异亮氨酸生产底盘菌株。大肠杆菌DH5α用于常规质粒繁殖和载体构建。自杀载体pK18mobsacB用于染色体基因编辑。
基因组操作
谷氨酸棒杆菌的基因组编辑使用pK18mobsacB衍生自杀载体，该载体携带突变或目标片段，两侧为约1,000 bp的同源臂。染色体修饰时，将1 μg相应质粒（如pK18-thrABC）通过电穿孔导入谷氨酸棒杆菌，经两步同源重组获得突变株。具体操作如下：转化子在含卡那霉素（25 μg/mL）的LBGB琼脂平板上筛选，富集单交换整合子；随后将重组菌在不含卡那霉素的LBGB培养基中培养4 h，梯度稀释后涂布于含10%（w/v）蔗糖的LBGB琼脂平板，以分离双交换突变株。候选菌落经菌落PCR和Sanger测序确认。
EcTD(P441F)突变体表达菌株的构建
所用质粒及突变引物序列分别见附表S1和S8。EcTD(P441F)突变体通过全质粒PCR定点突变获得。简要步骤如下：以重组质粒为模板进行PCR扩增；扩增产物纯化后用DpnI消化30 min，去除甲基化亲本质粒DNA；消化产物通过化学转化法转入化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，转化子培养用于后续实验[25]。
生物传感器的构建与表征
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组DNA为模板，用DNA聚合酶及附表S7所列引物对PCR扩增lrp基因和brnEF启动子N7（PbrnEFN7）。报告基因gfp通过基因合成获得。将lrp、PbrnEFN7和gfp片段分别通过同源重组（使用AB克隆酶，按制造商说明书操作）装配至质粒骨架pECXK99E、pXMJ19和pZK001中，分别生成生物传感器质粒pECXK99E-SensorIle、pXMJ19-SensorIle和pZK001-SensorIle[14, 26]。
三种构建体均包含相同的传感模块（由lrp、PbrnEFN7和gfp组成），区别在于质粒骨架不同。具体而言，pECXK99E提供相对简单的表达背景，常用于谷氨酸棒杆菌单基因表达；pXMJ19提供适合相对更强、更灵活基因表达的穿梭载体背景；pZK001为实验室构建的质粒，用作比较的替代骨架。因此，由于载体背景差异，三种生物传感器构建体预期表现出不同的传感性能。
重组质粒在用于后续生物传感器评估前经菌落PCR和Sanger测序验证。为表征生物传感器，将携带不同构建体的菌株在相同实验条件下培养，在一系列L-异亮氨酸浓度下测定其荧光响应。根据响应强度和响应范围比较生物传感器性能。三种构建体中，pECXK99E-SensorIle表现出最佳传感性能，因此被选用于后续筛选。
常压室温等离子体（ARTP）诱变
使用自动化常压室温等离子体（ARTP）诱变系统（无锡源清天木生物科技有限公司）对野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032进行随机诱变，方法如前所述[27]。以氦气为工作气体产生等离子体射流。喷嘴到样品距离保持2 mm，氦气流量设为10 L/min，射频功率固定为100 W[28]。为确定最佳处理时间，在一系列处理时间下评估谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的致死率[29]。简要操作如下：取10 μL新鲜制备的指数期细胞悬液均匀涂布于无菌金属板上，分别暴露于ARTP射流80、100、120、140或160 s。处理结束后，立即将金属板转移至含1 mL无菌蒸馏水的无菌微量离心管中重悬细胞。悬液梯度稀释后涂布于固体培养基，30 °C培养48 h。致死率计算公式为：
致死率(%) = [(C − S) / C] × 100
其中C为未处理对照的平均菌落数，S为ARTP处理样品的平均菌落数。菌落数通过菌落形成单位（CFU）测定法重复两次获得。
突变菌株遗传稳定性测试筛选
15代遗传稳定性评估的详细操作流程如下：
1. 种子培养：将菌株cgl-Ile0在LBGB固体培养基上30 °C活化24 h，挑取单菌落接种至50 mL LBGB液体培养基中，30 °C、220 r/min培养12 h获得种子液。
2. 连续传代：取1 mL种子液接种至50 mL新鲜LBGB液体培养基（接种量2%，v/v），相同条件下培养至对数生长期（OD600 ≈ 1.0–1.2），定义为一代。此操作连续重复15代。
3. 稳定性检测：分别在第1、5、10和15代后，将菌株接种至L-异亮氨酸发酵培养基，30 °C、220 r/min培养36 h。测定各代菌株的L-异亮氨酸产量和细胞生长量，以验证突变菌株的遗传稳定性[30, 31]。
全基因组测序与数据分析
对突变菌株cgl-Ile0进行全基因组重测序以鉴定突变位点。采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取基因组DNA，DNA质量通过1%琼脂糖凝胶电泳评估。Illumina双端（PE）文库构建及测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
生物信息学分析流程如下：使用fastp对原始读段进行修剪和质量过滤，去除低质量序列[32]；使用BWA-MEM算法将clean reads比对至亲本谷氨酸棒杆菌ATCC 13032参考基因组；使用Picard MarkDuplicates去除PCR重复[33]；基于所得BAM文件，使用SAMtools计算测序深度和基因组覆盖度；使用Snippy鉴定变异，随后根据测序深度和比对质量进行过滤[34]；保留的变异使用SnpEff进行功能注释，预测其潜在基因组效应。
蛋白表达与纯化
野生型及工程改造的TD和AHAS酶在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达。细胞在含卡那霉素（50 μg/mL）的30 mL LB培养基中37 °C培养至OD600为0.6–0.8。加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.42 mmol/L诱导蛋白表达，随后25 °C孵育14 h。细胞通过离心收集，离心条件为4,629 × g，10 min。
研究结果
通过生物传感器辅助ARTP诱变获得遗传稳定的L-异亮氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌cgl-Ile0，该菌株在5-L发酵罐中L-异亮氨酸产量为11.52 g/L，得率为0.11 g/g，生产强度为0.24 g/L/h。全基因组重测序揭示了四个与表型相关的突变，包括aspBV346I、asdP27E、brnEL87S和brnFR28P。
对两个限速酶——苏氨酸脱氨酶（TD）和乙酰羟基酸合酶（AHAS）——进行结构引导蛋白工程改造，获得菌株cgl-Ile1，其产量、得率及生产强度较菌株cgl-Ile0分别提高39.50%、27.27%和37.50%。
随后对L-异亮氨酸生物合成模块、草酰乙酸供应模块、辅因子供应模块及转运/外排模块进行模块化优化，获得最终菌株cgl-Ile8。
通过优化pH和溶解氧，菌株cgl-Ile8在5-L发酵罐中L-异亮氨酸产量、得率及生产强度分别达到48.49 g/L、0.31 g/g和1.01 g/L/h，分别为菌株cgl-Ile0的4.21倍、2.82倍和4.21倍。
放大至50-L发酵罐后，产量、得率及生产强度进一步提升至50.12 g/L、0.32 g/g和1.04 g/L/h，为目前谷氨酸棒杆菌中报道的最高L-异亮氨酸产量。
讨论与解读
本研究通过整合生物传感器引导的ARTP诱变、结构引导蛋白工程及模块化途径重排，成功构建了工业级L-异亮氨酸生产谷氨酸棒杆菌菌株。该策略有效克服了途径瓶颈酶的反馈抑制、前体供应不足及辅因子不平衡等限制，为构建GRAS氨基酸生产菌株提供了实用且可转移的技术框架。
编译者解读：本研究最值得借鉴之处在于将多种工程手段系统整合——从生物传感器高通量筛选锁定优势突变，到结构引导蛋白工程精准解除反馈抑制，再到模块化代谢重排平衡前体与辅因子供应。50.12 g/L的产量刷新了谷氨酸棒杆菌产L-异亮氨酸的纪录，证明了"随机诱变+理性设计+系统优化"这一组合策略在氨基酸工业菌株开发中的实用价值。值得注意的是，生物传感器辅助诱变有效解决了传统随机诱变筛选通量低的痛点，这一方法对其它支链氨基酸及衍生化学品的菌株开发同样具有参考意义。
参考来源
Cao J, Huang M, Sheng Q, Zhang L, Meng G. Systems metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for efficient production of L-isoleucine. J Anim Sci Biotechnol. PMID: 42415166. DOI: 10.1186/s40104-026-01459-y.
PMID: 42415166