来源：BMC Microbiol | 编译：DNA Lab Space
导读
吩嗪类化合物1-羟基吩嗪（1-OH-PHZ）兼具致病性与广谱抗菌活性，但天然产量长期制约其开发。本研究以埃及大麦根际分离的铜绿假单胞菌KAEH25为对象，整合纳米孔长读长测序、AlphaFold结构预测与Plackett–Burman/响应面统计学优化，将1-OH-PHZ产量提升至24.85 µg mL⁻¹，并证实其对多种致病菌具有选择性抑制活性。这一"基因组—结构—工艺"一体化框架为微生物次级代谢产物优化提供了可移植范式。
研究背景
铜绿假单胞菌是代谢适应性广泛的革兰氏阴性菌，也是免疫缺陷人群的重要条件致病菌。其次级代谢产物1-羟基吩嗪（1-OH-PHZ）是一种氧化还原活性毒力因子，通过产生活性氧导致宿主组织损伤。与此同时，1-OH-PHZ又通过氧化还原循环、破坏微生物细胞膜、抑制DNA/RNA合成、干扰生物被膜形成及与抗生素协同等机制表现出广谱抗菌活性。然而，其产量长期不足以支撑机制研究与生物技术应用。
吩嗪类化合物的生物合成由phz操纵子（含phzA-G及辅助基因phzH、phzM、phzS）指导，将莽草酸途径的分支酸转向特异性吩嗪中间体。具体而言，PhzE将分支酸转化为2-氨基-2-脱氧异分支酸（ADIC），PhzD将其裂解为trans-2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸，PhzF催化互变异构，PhzA与PhzB协作构建吩嗪骨架，PhzG催化氧化芳构化生成吩嗪-1-羧酸（PCA），再经PhzH/PhzS等修饰酶转化为终产物。
研究方法
细菌样品采集与筛选
根际土壤采自埃及梅努菲亚省种植四周的大麦（Hordeum vulgare L. 'Giza 132'）。采样深度5–15 cm，使用乙醇灭菌的不锈钢勺。约1–2 g土壤转入无菌50 mL无DNA/RNA聚丙烯管，冰上（<4 °C）运回，2 h内处理。取1 g土壤悬浮于9 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）中充分涡旋。用无菌PBS制备10⁻¹–10⁻⁴系列十倍稀释液。每个稀释度取100 µL涂布于Reasoner's 2A（R2A）琼脂和King's B琼脂，每个稀释度两个重复。平板在28 ± 1 °C有氧条件下培养48–72 h。呈现橙红色色素的菌落经LB琼脂两次划线纯化以确保克隆分离。产色素菌株通过以下方式筛选：（i）环境光下目视检查，（ii）365 nm紫外透射检测特征性橙色荧光，（iii）在367 nm处分光光度法测量色素提取物以确认吩嗪产生。
菌株与培养条件
铜绿假单胞菌KAEH25保存于含1.5% Bacto™琼脂的营养琼脂（NA）平板，4 °C短期保藏。种子培养：挑取单菌落接种于5 mL Lysogeny Broth（LB），37 ± 1 °C、180 rpm轨道摇瓶培养至OD₆₀₀达0.50 ± 0.02（18–24 h）。预培养物按1:100（v/v）稀释至50 mL新鲜LB培养基，相同温度与振荡条件下培养至对数后期（OD₆₀₀ ≈ 1.0）。培养过程定期分光光度监测以确保生长一致。所有实验在生物安全二级（BSL-2）条件下进行，仅涉及体外实验（细菌培养、基因组表征、代谢物提取、抗菌药敏测试），未进行动物实验、环境释放或临床应用。
DNA提取
使用DNeasy® Blood & Tissue Kit（Qiagen GmbH, Hilden, Germany, Cat. No. 69504）按制造商革兰氏阴性菌方案（版本10/2024）从新鲜培养菌体沉淀（≈10⁹ CFU）提取高分子量基因组DNA。沉淀重悬于180 µL Buffer ATL，加入20 µL蛋白酶K（≥600 mAU mL⁻¹），在ThermoMixer® C中56 °C、900 rpm振荡孵育30 min。加入200 µL Buffer AL后，70 °C孵育10 min，转移至置于2 mL收集管中的DNeasy Mini离心柱。6,000 × g离心1 min，依次用500 µL Buffer AW1和600 µL Buffer AW2洗涤（各8,000 × g，1 min），最后加入200 µL预热（65 °C）Buffer AE，膜上孵育5 min后8,000 × g离心1 min洗脱。DNA浓度与纯度（A₂₆₀/₂₈₀和A₂₆₀/₂₃₀比值）用NanoDrop™ 2000c UV–Vis分光光度计以1 × TE缓冲液校准后三次重复测量，获得40–60 ng µL⁻¹ DNA用于下游分析。系统发育分析中，16S rRNA基因序列用MUSCLE算法比对，选择ProscanGTR + G + I替代模型，在Geneious Prime® v.2025.0.5中以1,000次bootstrap重抽样构建最大似然系统发育树，分支长度以每位点0.02替换的遗传距离标尺计算。
16S rRNA分子鉴定
菌株从−80 °C甘油保存物中划线复苏于LB琼脂（Lennox配方，1.5% Bacto™琼脂，BD Franklin Lakes, NJ, USA），在Heratherm™ Compact培养箱（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）中37 ± 1 °C有氧培养18 h。挑取单菌落，用DNeasy® Blood & Tissue Kit（Qiagen, Cat. No. 69506）按革兰氏阴性菌方案提取基因组DNA，获得30–50 ng µL⁻¹高分子量DNA，A₂₆₀/₂₈₀比值为1.85–2.0（NanoDrop™ One, Thermo Fisher）。全长16S rRNA基因在25 µL反应体系中扩增，含1 × EmeraldAmp® GT PCR Master Mix（Takara Bio Inc., Shiga, Japan, Cat. No. RR310A）、各0.2 µM通用引物27F（5ʹ-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3ʹ）和1492R（5ʹ-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3ʹ）（Eurofins Genomics, Ebersberg, Germany合成）及约20 ng模板DNA。热循环在T100™ Thermal Cycler（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）上进行：94 °C初始变性3 min；30个循环的94 °C 30 s、55 °C 30 s、72 °C 90 s；72 °C终延伸5 min。扩增产物用QIAquick® PCR Purification Kit（Qiagen; Cat. No. 28104）纯化，在ABI 3730xl DNA Analyzer（Macrogen Inc., Daejeon, Republic of Korea）上双向测序。正向和反向读段导入Geneious Prime® v.2025.0.5（Biomatters Ltd., Auckland, New Zealand），质量修剪（Q ≥ 30）后组装为1,524-bp重叠群，对应完整16S rRNA基因。高质量共有序列提交至NCBI GenBank数据库，登录号PX255551。
纳米孔DNA测序与生物信息学分析
纳米孔文库制备与测序
从铜绿假单胞菌KAEH25提取的基因组DNA（≥50 ng µL⁻¹；A₂₆₀/₂₈₀ ≈ 1.8–2.0）用于制备Oxford Nanopore Technologies（ONT）测序文库，使用Ligation Sequencing Kit（SQK-LSK109, ONT）。末端修复和dA尾添加使用NEBNext® Ultra™ II End Repair/dA-Tailing Module（New England BioLabs, Cat. No. E7546），随后用NEBNext Quick T4 DNA Ligase（NEB, M2200）和ONT接头进行接头连接。约400 ng最终文库与ONT Library Loading Beads（EXP-LLB001）混合，装载到预处理的R10.4.1流动池（FLO-MIN106D）中，安装于MinION Mk1C设备。测序进行48 h，使用MinKNOW Core v21.02.3持续采集数据。碱基识别用Guppy v6.4.6（高精度模型）实时进行。所得FASTQ文件导入Geneious Prime® 2025.0.5进行接头修剪和质量过滤（Q ≥ 12）。使用Flye v2.9.2（repeat-graph模式，–nano-corr）进行从头组装，用Medaka v1.7.2对初步组装进行抛光，获得适用于下游分析的高连续性基因组。
基因组组装与注释
原始纳米孔测序读段导入Geneious Prime® 2025.0.5进行质量控制、碱基识别验证和组装。使用Geneious内置修剪工具去除接头和低质量区域（最低质量阈值Q ≥ 12）。使用Flye v2.9.2插件以长读段组装默认参数进行从头组装。使用Geneious Prime中集成的Medaka v1.7.2插件对初步基因组进行抛光。开放阅读框（ORF）预测与功能注释按标准流程进行。
Plackett–Burman筛选设计与响应面优化
Plackett–Burman筛选设计用于评估九个因素对1-OH-PHZ产量的影响。12次实验运行中，最高产量（20.9 µg mL⁻¹）出现在运行8，该条件为：温度37 °C、pH 7、1%葡萄糖、2 g L⁻¹蛋白胨、10%接种量、48 h培养、100 rpm振荡、0.1 mM Fe²⁺、不添加磷酸盐缓冲液。随后采用响应面法（RSM）对关键因素进行优化。
抗菌活性测定
采用孔扩散法（Well diffusion method）测定1-OH-PHZ及参考抗生素对不同细菌菌株的抗菌活性。测试菌株包括粪肠球菌（E. faecalis）、单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）、大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）、鼠伤寒沙门氏菌（S. enterica serovar Typhimurium）和肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）。
研究结果
16S rRNA系统发育鉴定
铜绿假单胞菌KAEH25的16S rRNA基因扩增获得1,524-bp连续序列，提交至GenBank（登录号PX255551）。BLASTn分析显示，与所有铜绿假单胞菌参考菌株和临床菌株的核苷酸一致性≥99.54%，其中四个菌株（CP174013、CP192623、MN547155和OQ168635）共享99.61%的一致性。最接近的非铜绿假单胞菌匹配为荧光假单胞菌SBW25，一致性为94.37%（1,416/1,502 bp）。最大似然系统发育重建将菌株KAEH25置于支持度极高的铜绿假单胞菌分支内（bootstrap 100%），与荧光假单胞菌SBW25明显分离（图1）。
1-OH-PHZ的UV–Vis光谱
1-OH-PHZ的UV–Vis吸收光谱（图2a）显示在261 nm处有主导吸收峰，为光谱中强度最高的特征。240 nm附近观察到肩峰，280 nm附近及300–340 nm区域出现额外弱特征。261 nm处的强吸收带（A ≈ 2.6）反映共轭芳香体系的π → π*跃迁。在主峰之外，光谱从280到400 nm呈现吸光度逐渐下降的趋势，表明较长波长处电子跃迁概率降低。同时，该色素在琼脂平板上呈现特征性橙色（图2b），与吩嗪产生一致。
吩嗪生物合成基因座的纳米孔测序与组装
纳米孔数据集质量评估显示1,222条高质量读段，总计约2.3 Mbp，GC含量62%。读段长度分布广泛，未检测到接头污染或过度代表性序列，无模糊碱基（N），表明数据集干净适合组装。从头组装产生了对应于吩嗪生物合成基因座的单一无缺口重叠群。组装区域包含七个连续的核心生物合成基因（phzB–phzH），沿正向链共线排列，以及上游的phzF异构酶基因（图3）。纳米孔测序在10,358-bp读段内捕获了整个基因座，覆盖位置424–10,358。所有生物合成基因及相邻侧翼基因均完全解析，长度和方向汇总于表3。
表3 铜绿假单胞菌KAEH25吩嗪生物合成基因座的基因组织与结构特征，包括基因坐标、长度、方向和注释功能
| 元件 | 坐标（bp） | 长度（bp） | 方向 | 功能 |
|------|-----------|-----------|------|------|
| phzB | 426–803 | 378 | 正向 | 吩嗪生物合成蛋白 |
| phzC | 1,118–2,131 | 1,014 | 正向 | 2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶 |
| phzD | 2,140–2,751 | 612 | 正向 | 2-氨基-2-脱氧异分支酸水解酶 |
| phzE | 2,881–4,646 | 1,896 | 正向 | 2-氨基-2-脱氧异分支酸合酶 |
| phzG | 5,611–6,204 | 594 | 正向 | 吡哆胺5′-磷酸氧化酶 |
| phzS | 6,535–7,830 | 1,296 | 正向 | FAD依赖性单加氧酶 |
| phzH | 9,991–10,350 | 360 | 正向 | 吩嗪修饰酶 |
同一读段捕获的侧翼基因：
| 基因 | 坐标（bp） | 长度（bp） | 方向 | 功能 |
|------|-----------|-----------|------|------|
| fptX | 8,187–8,558 | 372 | 反向 | 内膜通透酶（铁吡虫啉摄取） |
| hypothetical-1 | 8,647–8,784 | 138 | 正向 | 假设蛋白 |
| hypothetical-2 | 8,818–9,090 | 273 | 反向 | FIG00960617假设蛋白 |
| hypothetical-3 | 9,081–9,710 | 630 | 反向 | FIG00960617假设蛋白 |
InterProScan注释与二级结构预测
InterProScan和二级结构分析在所有吩嗪生物合成酶中鉴定出保守结构域和特征性折叠（图4）。PhzB（126 aa）含有PHZA/PHZB Pfam结构域（aa 3–69），呈现N端α-螺旋后接紧凑β-三明治结构（图4a）。PhzC（339 aa）呈现典型的TIM-桶状结构，与2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶II一致，交替的β-链和α-螺旋插入形成催化桶（图4b）。PhzD（203 aa）显示异分支酸酶型折叠，由中央平行β-折叠片两侧环绕七个α-螺旋构成预测的底物结合口袋（图4c）。
PhzE（≥866 aa）的N端区域采用氨基转移酶样α/β折叠，为PLP依赖性酶的特征，多个β-链散布于α-螺旋之间（图4d）。PhzG（322 aa）展示FMN结合分裂桶结构域架构，具有围绕螺旋核心的弯曲β-折叠片，为吡哆胺-5′-磷酸氧化酶的典型特征（图4e）。PhzS（417 aa）具有FAD依赖性单加氧酶折叠，包括N端螺旋帽和与FAD/NAD(P)H相互作用相关的延伸Rossmann样β-折叠片（图4f）。PhzH（120 aa）显示HUP家族核苷酸结合折叠，包含N端螺旋、βαβ基序和多个与谷氨酰胺依赖性酰胺酶活性一致的螺旋插入（图4g）。基于AlphaFold的建模为全部七种吩嗪生物合成酶产生了高置信度三维结构（图5）。这些模型共同确认KAEH25编码结构完整且功能连贯的吩嗪生物合成途径。
基于基因簇分析的吩嗪生物合成途径重建
对组装基因座的分析确认了铜绿假单胞菌KAEH25中吩嗪生物合成所需全部酶的存在和组织（图6）。重叠群包含完整核心生物合成基因集，包括phzE、phzD、phzF、phzB和phzG，以及末端修饰基因phzH和phzS，各基因沿正向链依次排列。恢复的基因顺序和方向与经典吩嗪生物合成途径精确对应，该排列使分支酸来源的中间体逐步转化为吩嗪-1-羧酸（PCA）及其下游产物。phzH和phzS的存在进一步确认了该途径将PCA分别导向吩嗪-1-甲酰胺和1-OH-PHZ形成的能力。
Plackett–Burman设计优化1-OH-PHZ产量
Plackett–Burman筛选在12次实验运行中鉴定出1-OH-PHZ产量的显著变异，最高产量（20.9 µg mL⁻¹）出现在运行8。该条件为：温度37 °C、pH 7、1%葡萄糖、2 g L⁻¹蛋白胨、10%接种量、48 h培养、100 rpm振荡、0.1 mM Fe²⁺、不添加磷酸盐缓冲液。温度、蛋白胨浓度和葡萄糖水平对产量影响最为显著。较高蛋白胨（2 g L⁻¹）始终对应更高产量，而1%葡萄糖比2%支持更高产量。不添加磷酸盐缓冲液与最高产量运行中的产量升高相关。操作因素也有贡献：100 rpm振荡比200 rpm产量更高，48 h培养比24 h提高产量。接种量在测试范围内无一致影响。筛选数据共同描绘了最佳参数组合：37 °C、pH 7、1%葡萄糖、2 g L⁻¹蛋白胨、10%接种量、48 h、100 rpm、0.1 mM Fe²⁺、零磷酸盐缓冲液，该组合获得最高实测1-OH-PHZ浓度（表4）。
响应面优化与模型验证
响应面法（RSM）进一步优化关键因素间的交互效应。扰动图（图8）展示了1-OH-PHZ产量对各个实验因素变化的敏感性。响应面图（图9a–k）展示了关键理化与营养因素对铜绿假单胞菌KAEH25产1-羟基吩嗪的交互效应，包括温度×pH（AB）、pH×葡萄糖（BC）、pH×蛋白胨（BD）、pH×磷酸盐缓冲液（BH）、葡萄糖×蛋白胨（CD）、葡萄糖×接种量（CE）、葡萄糖×培养时间（CF）、葡萄糖×振荡速度（CG）、蛋白胨×接种量（DE）、蛋白胨×振荡速度（DG）和接种量×振荡速度（EG）共11组双因素交互。优化后的条件（37 °C、pH 6.5–7、1%葡萄糖、2 g L⁻¹蛋白胨、10 mL接种量、48 h）下，1-OH-PHZ最高产量达到24.85 µg mL⁻¹。统计模型表现出卓越的解释力（R² = 0.9605；Adeq Precision = 19.11）。
抗菌活性测定
初步抗菌试验显示1-OH-PHZ具有选择性抗菌活性（图10）。孔扩散法测定结果：对大肠杆菌抑制圈为20 ± 1 mm，对鼠伤寒沙门氏菌为13 ± 0.5 mm，对肺炎克雷伯菌为13 ± 0.7 mm，对金黄色葡萄球菌为8 ± 0.3 mm；对粪肠球菌和单核细胞增生李斯特菌未观察到抑制。
讨论与解读
1-OH-PHZ作为铜绿假单胞菌产生的微生物吩嗪代谢物，具有广谱抗菌活性，在植物病害防治方面具有应用潜力。该化合物同时也是能够产生活性氧的毒力因子。基因组学、结构生物学和生物过程优化的最新进展为提升其产量提供了有力途径。纳米孔测序、AlphaFold酶结构预测与Plackett–Burman实验设计的整合代表了一种协同的、系统层面的方法，可理性增强铜绿假单胞菌中1-OH-PHZ的生物合成。该策略为可持续农业提供了可扩展的绿色合成杀菌剂替代方案。其作为防御代谢物和毒力相关氧化还原活性化合物的双重角色，说明了吩嗪在铜绿假单胞菌中复杂的生态功能。这些特性强调了开发精确生物合成优化策略的重要性，该策略应增强有益活性同时减轻致病属性。本研究采用的基因组、结构和生物过程整合方法为理性增强1-OH-PHZ生物合成提供了连贯框架。
菌株KAEH25的分类学分析得到16S rRNA序列一致性和系统发育位置的强力支持。1,524-bp扩增子（GenBank: PX255551）与所有铜绿假单胞菌参考菌株的一致性≥99.54%，系统发育树中以100% bootstrap值将其置于铜绿假单胞菌分支内。纳米孔长读长测序完全解析了10,358-bp吩嗪生物合成基因座，确认核心基因（phzB–phzG）和修饰基因（phzH、phzS）的完整组织。AlphaFold建模与InterProScan分析验证了所有途径酶的保守催化结构域，确认功能连贯性。Plackett–Burman筛选确定温度、pH、葡萄糖、蛋白胨、接种量和培养时间为显著产量决定因素，响应面法优化后实现最高1-OH-PHZ产量24.85 µg mL⁻¹。该统计模型表现出卓越的解释力（R² = 0.9605；Adeq Precision = 19.11）。初步抗菌试验证明1-OH-PHZ的选择性活性，对大肠杆菌抑制圈达20 ± 1 mm，对鼠伤寒沙门氏菌和肺炎克雷伯菌均为13 mm级别，对金黄色葡萄球菌为8 ± 0.3 mm，而对粪肠球菌和李斯特菌无抑制。这一系统引导的方法为优化微生物次级代谢产物提供了可转移平台，并验证了1-OH-PHZ作为抗菌药物开发的有前景先导化合物。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于将三代测序、AI结构预测与经典统计优化三种工具串联为一条完整管线——先用纳米孔测序一次性闭环解析整个10.4 kb基因簇，再用AlphaFold确认每个酶的结构完整性，最后用Plackett–Burman+RSM把产量从20.9推到24.85 µg mL⁻¹。这种"先证明基因没问题，再全力调工艺"的逻辑避免了盲目优化。不过，24.85 µg mL⁻¹的绝对产量仍属实验室水平，距工业化尚有距离；且1-OH-PHZ对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌仅8 mm抑菌圈）活性偏弱，其选择性抗菌谱的机制值得后续深究。
参考来源
El-Mongy MA, Abuelhaded K, AbdelKhalek A, Faraag AHI. Modular integration of nanopore sequencing, alphafold modeling, and statistical design boosts 1-hydroxyphenazine yield in Pseudomonas aeruginosa strain KAEH25. BMC Microbiol. PMID: 42443741. DOI: 10.1186/s12866-026-05221-2.
PMID: 42443741