来源：蛋白结晶出晶率低沉淀剂筛选（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
蛋白结晶筛了两周，孔里还是清液、细沉淀或油滴？出晶率低，别急着怪蛋白。沉淀剂种类、浓度窗口、pH、离子强度、温度、接种，每个环节都能把命中率压下去。下面按“先排低级错，再按流程拆，再啃疑难”走一遍，覆盖沉淀剂筛选的实操参数和验证动作。这篇只讲能落地的排查动作，不讲空泛原理。你照着做，至少能少筛两块板。
第一步：快速排查低级错误
1. 蛋白浓度虚高或虚低。测A280时用同缓冲液做空白，浓度低于5 mg/mL先浓缩到10–20 mg/mL，SDS-PAGE看纯度。解决：重测后按1 µL蛋白+1 µL池液坐滴。
2. 沉淀剂母液配错。30% PEG 3350按w/v配，4 M硫酸铵别把体积当质量。解决：新配母液，查电导率或折光，储液孔加100 µL。
3. 封膜漏气或加样气泡。坐滴1 µL+1 µL，别打出气泡，封膜压紧。解决：20°C静置，24 h内看是否蒸发。
4. 温度记录混乱。20°C和4°C各一套，别混放。解决：贴标签，第1、3、7天拍照记录。
第二步：分维度系统排查
1. 样品均一性不够
现象：清液或细沉淀，久置只有无定形。原理：聚集体抢走可溶蛋白，成核界面变脏。解决：SEC过Superdex 200，收主峰，换20 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl；浓度定10 mg/mL。验证：DLS多分散指数<0.3，SEC无前肩。
2. 沉淀剂家族太单一
现象：96孔里只有边缘孔沉淀，中心全清。原理：PEG、盐、有机溶剂成晶机制不同，单一家族窗口窄。解决：初筛铺三家族——PEG 3350 8–30%、PEG 4000 10–25%、硫酸铵0.8–2.5 M，pH 4.5–8.5，1:1坐滴。验证：命中孔做24孔梯度，沉淀剂步长2–5%。
3. pH和离子强度没拉开
现象：某pH附近出现微晶或相分离。原理：接近pI蛋白溶解度低，盐屏蔽电荷。解决：pH 0.5单位一格，柠檬酸5.0–6.0、Tris