来源：固相萃取回收率低填料活化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做SPE的人都有过这种经历：方法照文献抄的，柱子是原装的，标准品新鲜配的，结果回收率一跑只有55%，平行样还飘。别急着怀疑仪器，八成问题出在柱子本身——填料没活化好。这篇教程按上柱流程拆成五个模块，从低级错误到疑难杂症逐层排查，每一步都给出判断依据、验证动作和具体参数，你照着做就能把回收率拉回85%以上。
第一步：先花5分钟排掉这几个低级错误
新手栽跟头，往往不是方法错，是动作糙。下面4条，中一条就够你忙半天。
1. 甲醇润柱后让柱子干掉。 抽真空把甲醇抽过筛板、填料变白，C18链直接塌陷。解决：润柱后立刻续水平衡，液面永远不低于筛板。
2. 活化体积抠门。 100 mg的柱子只过0.5 mL甲醇。解决：按填料量给，100 mg柱用甲醇1 mL、水平衡1 mL，500 mg柱翻倍。
3. 样品溶剂太"强"。 用含20%乙腈的溶液上C18柱，目标物直接穿柱。解决：稀释到有机相≤5%，再上样。
4. 全程靠重力自然滴。 流速忽快忽慢，柱床被冲乱。解决：接真空歧管控在-5 kPa左右，或者用正压，稳定在1 mL/min。
第二步：按流程分模块系统排查
回收率低不是单一原因，得把柱子拆成"活化—上样—淋洗—干燥—洗脱"五段，逐段看目标物漏在哪一段。做法很简单：每段流出液都单独收集，进一针，看目标物出现在不该出现的地方。下面按段说。
1. 活化与平衡：填料没润湿
现象：上样流出液里目标物占比超过30%，回收率常年在40%上下。
原理：C18、HLB这类反相填料表面是疏水长链，出厂干燥状态下链是蜷缩的。纯水根本润不进去，水只是从颗粒缝隙里"绕"过去，目标物没有分配位点可结合。甲醇、乙腈这类有机溶剂先把链撑开，水再把柱子里的有机相置换掉，填料才真正"开门营业"。
解决步骤：甲醇1 mL过柱，流速1 mL/min，约1滴/秒，别抽干；紧接着水平衡1 mL，同样速度；平衡完的柱子不能放超过10分钟，放久了填料又干。
验证方法：用0.1%亚甲蓝水溶液1 mL过柱，正常活化的C18柱颜色均匀、无白斑；有白斑说明润湿不完全，重新活化。
2. 上样：pH和溶剂强度没对上
现象：上样流出液里有明显目标峰。
原理：反相保留靠目标物呈中性分子态。酸性化合物（pKa 4左右）在pH 7的水里解离成离子，根本不保留；碱性化合物在酸性条件下同理。样品溶剂里有机相超过5%，洗脱强度就接近淋洗液，目标物跟着穿柱。
解决步骤：酸性化合物把样品调至pH 2–3，碱性化合物调至pH 8–9（用C18时）；用MCX柱则反过来，上样液调到0.1%甲酸、pH<2，让碱性物带正电被阳离子交换位点抓住。 solvent强度不够就用0.1%甲酸水或20 mM磷酸盐缓冲液稀释5倍再上。
验证方法：收集全部上样流出液，氮吹浓缩后进样，目标物峰面积应低于总量的5%。
3. 淋洗：洗得太狠
现象：淋洗液里目标物超过5%，回收率偏低但上样流出液干净。
原理：淋洗的目的是冲走基质，但甲醇比例超过10%就开始和目标物抢位点。100 mg柱淋洗体积超过2 mL，保留弱的化合物也会被拖走。
解决步骤：C18柱用5%甲醇水（或5%乙腈水）1 mL淋洗，一次即可；MCX柱用0.1%甲酸水1 mL，别加有机相。淋洗靠真空慢抽，30秒抽完。
验证方法：淋洗液单独收集进样，目标物占比<5%算合格；超标就把甲醇比例降到2%。
4. 干燥：水没抽干净
现象：洗脱液浑浊、分层，或者回收率忽高忽低。
原理：C18和HLB柱床残留的水会把洗脱液里的甲醇稀释，实际洗脱强度掉一档；离子交换柱（MCX/MAX）残水还会导致洗脱液pH变化，目标物解离不出来。
解决步骤：淋洗后真空抽5–10分钟，-5 kPa，室温；离子交换柱可延长到15分钟。别用高温烘，40°C以上某些聚合物填料会变形。
验证方法：抽完对着光看柱床，呈均匀粉末状、无镜面反光即可。
5. 洗脱：体积和次数不够
现象：第一次洗脱只回收60%，第二次洗脱还能检出30%。
原理：洗脱是分配平衡过程，1 mL甲醇一次过柱，只有部分目标物被带出；分两次、每次0.5 mL，总回收率能差15个百分点以上。
解决步骤：甲醇或乙腈1 mL，分两次各0.5 mL；每次加液后浸泡30秒再抽，流速压到0.5 mL/min。碱性化合物用含0.5%氨水的甲醇，酸性化合物用含0.5%甲酸的甲醇。
验证方法：洗脱液分两管收集，第二管目标物应低于总量10%；高于这个数说明该换更强溶剂或加体积。
第三步：进阶疑难，看看你踩的是哪一种
情况一：柱床干裂、出现沟流。 真空抽得太狠（低于-20 kPa）或上样流速超过2 mL/min，填料被冲出一条通道，液体走捷径，一半填料根本没接触样品。判断方法：回收率低且平行样差异大（RSD>15%）。解决：弃用该柱，重新装柱或换预装柱；后续全程控流速在1 mL/min以内，真空不超过-5 kPa。
情况二：硅胶基质柱回收率随批次漂。 碱性化合物在C18硅胶柱上会和残余硅醇基发生次级作用，怎么洗都有10–20%下不来。解决：洗脱液里加0.1%三乙胺封端，或者直接换聚合物基质的HLB柱。验证：同一批样品上两种柱子对比，差异>10%就换柱。
情况三：基质效应伪装成回收率低。 实际回收率90%，但基质抑制让峰面积掉了40%。判断方法：做基质加标（空白基质加标准品）和纯溶剂标准曲线对比，斜率差>15%就是基质效应。解决：改内标法，用同位素内标校正；或增加淋洗强度、上样前做蛋白沉淀。
避坑总结：3条结论 + 2个好习惯
1. 活化体积按填料量算，100 mg柱甲醇1 mL打底，润完立刻续水，液面不见底。
2. 上样前必调pH和有机相比例，酸性调pH 2–3、碱性调pH 8–9，有机相压到5%以下。
3. 洗脱分两次、每次0.5 mL、浸泡30秒，比一次1 mL快抽多回收10–15%。
日常两个好习惯：每批新柱子先做一次空白加标验证回收率，记录批号；每段流出液都留样，出问题直接定位，不用重做整批。
需要配套工具？
SPE做完往往接LC-MS/MS定量，标准品从哪来？重组蛋白表达是最常见路径。做表达构建时，引物设计可以用站内工具先跑一遍，避免错配；序列拿到后做密码子优化，提高可溶性表达比例；表达出来条带在包涵体里，再用蛋白可溶性优化工具调标签和促溶条件。三步串起来，标准品和阳性对照就不愁了。