来源：胞外囊泡分离超速离心破损率（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑完100,000g，管底一小块半透明沉淀，重悬后一测NTA：主峰从130 nm掉到80 nm，颗粒数还少了一半。这并不说明提纯成功，你的EV碎了。破损率高的麻烦在于它不会报警。蛋白浓度照样有，WB照样出条带，只有做功能实验、电镜或者体内注射时才暴露。这篇把超速离心法从样品准备到重悬保存拆成9个排查点，每点给判断方法、验证手段和具体参数。照着走一遍，基本能锁定问题出在哪。
第一步：先排除4个低级错误
别急着怀疑方法，先看这几条。新手翻车八成在这里。
1. 转子没预冷就上样——转子腔降到4°C至少需要1 h，匆忙上机会让样品在前20 min处于20°C以上，膜流动性升高。解决：转子提前1 h放4°C，或开机预冷到位再装管。
2. 超离管没装满——只装2/3，38,000 rpm下管壁会变形甚至内塌，颗粒撞壁破裂。解决：按转子说明书装到额定体积，配平到0.01 g。
3. PBS没过滤——未过膜的PBS本身能贡献10⁸/mL的背景颗粒，把破损率算高。解决：0.22 µm过滤后使用，现配现用。
4. 用涡旋仪重悬沉淀——这一步的损伤比离心本身大。解决：换成剪去尖端的宽口枪头，轻柔吹打。
第二步：按流程分模块系统排查
模块A：离心前（样品准备）
1. 碎片去除不彻底
现象：NTA出现>500 nm的肩峰，重悬液浑浊。
原理：细胞碎片和凋亡小体在100,000g同样沉底，它们比EV脆，重悬时先碎，碎片混进EV峰里。
解决：300g 10 min → 2,000g 20 min → 10,000g 30 min，全程4°C，每次吸上清时底部留5 mm不吸。
验证：取10,000g上清直接测NTA，>300 nm颗粒应<5%。超标就补一次10,000g 30 min。
2. 上样体积与管型不匹配
现象：管底沉淀薄而散，稍微多加PBS就浑。
原理：液柱过高，颗粒沉降路径变长，一部分沉到管壁而不是管底；刮取时必然损伤。
解决：13.2 mL薄壁管装10.5 mL，36 mL管装32 mL。上清超过250 mL先10,000g 30 min预浓缩，或用切向流浓缩到30 mL以内。
验证：离心结束用手电筒侧照管壁，有一层白色附着说明沉到壁上了，下次减体积。
3. 样品黏度过高
现象：血浆、血清样品沉淀松散，重悬后有明显聚团。
原理：总蛋白>60 mg/mL时颗粒沉降受阻，为了收得更多只能提高离心力，压力随之上升。
解决：血浆用PBS按1:3稀释再超离；蛋白浓度极高的样品改用SEC打头阵。
验证：测上清总蛋白（BCA法），超过60 mg/mL就该稀释。
模块B：离心中（参数与转子）
4. 离心力或时间过头
现象：沉淀紧贴管底，成了刮不下来的硬饼。
原理：超过120,000g、超过120 min，EV被压成膜融合的聚集体，重悬时的机械力会直接撕开。
解决：主离心100,000g 70 min，洗涤100,000g 70 min。宁可多跑一次，也别一次跑过头。
验证：重悬后NTA主峰应在100–150 nm，PDI<0.3。峰左移到80 nm以下，就是压过头了。
5. 减速用刹车
现象：回收率低，沉淀被重新卷回上清，只好延长离心补救。
原理：刹车时转子腔内形成涡流，剪切力可达数百帕，足以撕破已沉降的膜结构。
解决：减速设brake 0，自然减速约20–30 min。这半小时省不得。
验证：停机后看沉淀是否还在管底中央、边缘是否完整。
6. 转子类型选错
现象：固定角转子离完，沉淀贴在管壁侧面一条线上。
原理：固定角30°沉降，颗粒撞壁后粘附，刮取时必然损伤。
解决：小体积用水平转子（如SW41，100,000g 70 min）；大体积用固定角转子，但重悬时枪头对准沉淀那条线，别满管乱扫。
验证：离心后侧照定位沉淀，记录位置再重悬。