来源：细胞培养支原体污染PCR快检排除（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
细胞养着养着，增殖慢了、形态散了，你第一反应是不是支原体？上PCR一测，有人条带漂亮得可疑，有人该出的带死活不出，还有人今天阴明天阳。别急着扔培养瓶。这篇就把支原体PCR快检从取样到判读的排查路径拆开讲清楚：哪些是低级操作错误，哪些是模板和体系的坑，怎么验证，怎么避。照着做，一次过。
第一步：先别怀疑试剂盒，查这几个低级错误
新手90%的"疑难杂症"都出在这几步上，先花10分钟自查。
1. 取样取了细胞沉淀，没取上清。支原体是胞外寄生为主，取1 mL培养上清就对了，别拿胰酶消化下来的细胞团去煮。解决：换液后培养48–72小时的上清，直接取1 mL。
2. 上清没离心就直接煮。12000 g、4°C离心10分钟，取上清200 μL做模板制备，否则细胞碎片和蛋白会拖垮扩增。
3. 忘记做阴性对照（空培液）和阳性对照。没有对照，阳性你不敢信，阴性你不敢下结论。解决：每批都配一个未接种细胞的新鲜培养液做阴性，一个已知支原体DNA或质粒做阳性。
4. 加样区用了同一个移液器。气溶胶污染最常见来源就是这个。解决：配液、加模板分房间分枪，模板最后加、加完立即关管。
第二步：按流程分维度系统排查
模块一：取样与前处理（假阴性高发区）
现象：阳性对照亮，样品全阴，但你明显怀疑细胞有污染。
原理：培养液里的血清蛋白、酚红、SDS、EDTA都是Taq聚合酶抑制剂。煮沸法裂解不彻底，蛋白变性不充分，会直接压住扩增。
解决步骤：
① 取上清1 mL，12000 g离心10分钟去细胞碎片；
② 取上清900 μL，加等体积裂解液或用煮沸法：95°C 10分钟，冰浴2分钟；
③ 关键一步——把模板稀释10倍再用，取2 μL加入20 μL体系。稀释能稀释掉大部分抑制剂；
④ 如果培养基含高浓度血清（＞20%），建议先12000 g离心后取上清再沸水浴，别整管直接煮。
验证：同一个样品做原液和1:10稀释两个模板平行扩增，稀释后出带、原液不出，就是抑制物问题。
模块二：PCR体系与引物（假阳性/非特异带）
现象：阴性对照也出带，或者条带位置不对、拖尾。
原理：支原体16S rRNA保守区引物通用性强，也容易和别人撞。引物浓度过高、循环数过多，非特异产物就上来了。
解决步骤：
① 常用体系20 μL：10×Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL（终浓度200 μM），上下游引物各0.4 μL（终浓度0.2 μM），Taq 0.2 μL，模板2 μL；
② 退火温度先按引物Tm−5°C设，55–60°C之间做梯度，别直接照抄文献的58°C；
③ 循环数压到30–32，别贪35以上；
④ 每批必设无模板对照（NTC），NTC出带立刻停，做去污染。
验证：把产物跑2%琼脂糖、120 V 30分钟。目的带单一、NTC空白，才算体系干净。有杂带就先做温度梯度。
模块三：扩增与判读（结果可信度）
现象：条带很弱，或者弱到只有手机拍照才看得见。
原理：支原体载量低时（早期污染），1 mL上清里拷贝数本来就少，加上裂解损失，弱带很常见。
解决步骤：
① 提高上样量到5 μL（同体系下），或把模板浓缩：12000 g离心后取沉淀重悬于50 μL水再煮；
② 延长延伸时间到45秒–1分钟（产物270 bp左右，30秒够用，但弱信号可加长）；
③ 弱带必须复检一次，不同批次上清重取，两次都出同位置带才判阳性。
验证：弱阳性样品同时做支原体培养法或Hoechst 33258染色做交叉确认，别只凭一条弱带就清库。
模块四：污染溯源（连续阳性的真凶）
现象：阴性对照偶尔也出带，或者同批样品成片阳。
原理：扩增产物气溶胶、质粒阳性对照洒漏，都会让整个实验室"假阳性"。
解决步骤：
① 停做一周，全部换新试剂分装，移液器用10%次氯酸钠擦、紫外照30分钟；
② 阳性对照质粒稀释到10⁴拷贝/μL以下分装小管，用完即弃；
③ 加模板在独立洁净台，扩增后不开盖跑胶，或改用UNG酶体系（dUTP替换dTTP，37°C 10分钟预处理）。
第三步：进阶疑难问题
① 细胞株本身带抑制物。有些肿瘤细胞系（如某些白血病株）上清里核酸酶活性高，模板一煮就降解。判断：加外源对照模板共扩增，外源也不出就是抑制。解决：上清先加蛋白酶K 55°C 30分钟消化，再95°C 10分钟灭活。
② 培养液里的抗生素掩盖了污染。常规加双抗（青霉素-链霉素）压着支原体，载量低到PCR边缘。判断：撤抗生素传两代再取样。解决：停药培养72小时再取上清，检出率明显提高。
③ 假阳性来自引物二聚体。NTC出小带、位置低于目的带，多半是二聚体。解决：引物降到0.1 μM，或加1% DMSO、改用热启动Taq。
避坑总结 + 实操建议
三条核心结论：
1. 取样一律用换液后48–72小时的上清1 mL，离心12000 g 10分钟，别图省事整管煮。
2. 每批必带阴性、阳性、NTC三个对照，少一个结果就不作数。
3. 弱带不复检不算阳性，两次同位置出带再动手清库。
两个日常好习惯：
① 每批试剂开封就分装成小管，−20°C存，反复冻融不超过3次；
② 培养箱水盘每月换无菌水、加少量杀菌剂，支原体最爱从水盘走。
工具衔接
引物不稳、想自己设计一对支原体16S特异性引物？站内的引物设计工具可以直接跑Tm和特异性比对，比临时改文献参数靠谱。确认污染清完、细胞要重新建库表达蛋白，顺手用密码子优化工具把序列调一遍，再用蛋白可溶性优化工具评估表达方案，从源头减少返工。检测和表达本来就该一条线走完，别等蛋白不出才回头查污染。