来源：核酸提取宏基因组宿主DNA去除（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做了三批去宿主，宿主reads还是占30%以上，微生物那边只剩几百个种。是酶不行，还是流程有坑？宏基因组去宿主这事，问题常常出在选择性裂解的窗口太窄、DNase 的缓冲环境不够合适、纯化回收的损耗太大；试剂盒本身反而是次要因素。这篇按样本端到数据端的顺序逐项说明，每个原因给出判断、验证和解决动作，你对着自己流程逐条打钩就行。
第一步：先查这几个低级错误，别急着换试剂盒
1. 皂苷浓度算错。选择性裂解要 0.05% 终浓度的皂苷，母液配成 5%，1 mL 体系应加 10 µL；很多人只加了 1 µL，宿主细胞根本没破。解决：现配母液，加完按体积复核一遍。
2. 宿主裂解后没离心弃上清。37°C 孵育 10–15 min 后要 8000×g 离心 5 min，宿主DNA 随上清走，不弃上清等于没做去宿主。解决：把“弃上清”写进流程卡。
3. DNase 体系里没有 Mg²⁺。苯甲酸酶要 Mg²⁺（0.5–2 mM），样本带进来的 EDTA（TE 保存液、洗脱液）会直接让酶失效。解决：补 1×DNase 缓冲液或 1 mM MgCl₂，EDTA 终浓度压到 0.1 mM 以下。
4. 失活不彻底或过度。EDTA 终浓度 5–10 mM 或 75°C 10 min 二选一，不彻底会残留酶活，过头则损伤微生物DNA。解决：同一批样本固定用同一种失活方式。
第二步：按流程分维度系统排查
1. 样本端：宿主细胞已经把上限压得很低
现象：同一套流程，拭子样本宿主占 50%，粪便样本只占 2%。
原理：上皮细胞占拭子细胞总数的绝大多数，去宿主方法的处理能力有上限，通常只降 1–2 个数量级。
判断：做一次不处理对照的 qPCR，测人源 RNase P 拷贝数，每微升超过 10⁵ 拷贝基本就是样本问题。
解决：采样时旋转拭子 5–10 秒、不摩擦，取中段；粪便或环境样本用 0.22 µm 过滤，或 200×g 低速离心 5 min 去大颗粒。
验证：同批样本处理前后人源 qPCR 的 Ct 差值 ≥5。
2. 选择性裂解：窗口没卡准，宿主和微生物一起受损
现象：宿主去得多，细菌也掉一半。
原理：皂苷/Triton 破哺乳动物细胞膜，细菌细胞壁耐受，但这个窗口很窄，多放 10 分钟就开始伤革兰阴性菌。
判断：裂解后显微镜看完整上皮细胞比例，超过 20% 说明没裂透。
解决：皂苷 0.025%–0.05%，冰上 10 min 或室温 5 min，别超过 15 min；裂解完立刻加 DNase，别在室温搁 20 min。
验证：处理后 16S qPCR 回收率 ≥70%，人源 ≤10%。
3. DNase 消化：酶量、时间、缓冲液三条腿
现象：Ct 值上去了，但宿主 qPCR 还是阳性。
原理：DNase I 需要 Mg²⁺，37°C 最适，被 EDTA 和高盐抑制；酶单位不够就是消化不完全。
判断：做一个加酶/不加酶平行对照，同时测宿主和 16S。
解决：25–50 U 苯甲酸酶，37°C 30 min，体系 MgCl₂ 1 mM；样本体积占比不超过 1/10，避免抑制剂浓度过高。
验证：加酶组宿主 qPCR 的 Ct 比不加酶组高 ≥3，且 16S 信号不掉超过 30%。
4. 失活与纯化：把 DNase 清干净，别把 DNA 也清没了
现象：洗脱下来只有 1–2 ng/µL。
原理：柱纯化对小于 100 bp 的片段结合差，乙醇残留抑制后续建库；磁珠比例过高会连短片段一起带走。
判断：Nanodrop 看 230/260 比值，低于 1.8 大概率有残留。
解决：EDTA 5 mM 终止或 75°C 10 min；磁珠法用 1.8× 体积，不要超过 2×；洗脱 30 µL，37°C 预热后上柱。
验证：加 10 ng λ DNA 做回收率加标，正常应 ≥80%。
5. 甲基化法（MBD-Fc 类）：盐浓度和蛋白比例是关键
现象：宿主降了，拟杆菌门也跟着少。
原理：MBD 结合甲基化 CpG，结合强度依赖 NaCl 浓度，300–500 mM 是常用区间；比例失衡会非特异吸附。
判断：用宿主/细菌 gDNA 混合梯度做富集曲线。
解决：盐浓度 350 mM，蛋白:DNA 比 1:10 到 1:20，4°C 30 min，别在室温操作。
验证：处理前后内参 qPCR 算富集倍数，宿主 ≥10 倍、细菌 ≤2 倍损失