来源：CRISPR干扰菌群丰度变化定量校正（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
你做完CRISPRi，qPCR一跑，目标菌掉了，对照也掉了；16S相对丰度更热闹，和CFU对不上。别急着换引物。这类问题大概率出在归一化和采样偏倚。本文按构建、诱导、采样、提取、定量、校正六个环节，给你一套能落地的排查路径，覆盖qPCR、ddPCR和spike-in校正。
第一步：快速排查低级错误
- gRNA克隆是空载：菌液PCR只出载体骨架条带，没有插入片段。直接挑单克隆送Sanger，别用混合质粒往下做。
- 诱导剂浓度或时间记错：aTc母液反复冻融，实际浓度掉到一半。重新配1 mg/mL母液，-20°C避光分装，诱导时用200 ng/mL。
- 采样体积不一致：这管取0.5 mL，那管取1 mL，16S总量当然对不上。固定取1 mL菌液，8000×g、4°C离心5 min，弃上清后立即-80°C冻存。
- qPCR NTC有Ct<35：大概率是引物二聚体或气溶胶污染。换新 aliquots，反应体系配在超净台，NTC必须无Ct<35。
第二步：分维度系统排查
1. DNA提取偏倚让目标菌“凭空消失”
现象：16S相对丰度降了30%，qPCR绝对量只降8%，CFU不变。原理：厚壁菌、革兰阳性菌破壁效率低，提取柱对高GC DNA有保留差异。解决：取1 mL菌液，8000×g、4°C离心5 min；加0.1 mm锆珠0.1 g，30 Hz振荡60 s两次，间隔2 min；蛋白酶K终浓度200 µg/mL，56°C孵育30 min