来源：核酸凝胶染色灵敏度低染料浓度优化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑完胶，marker亮得刺眼，样品条带却像被雾吞了。昨天还能看见的50 ng条带，今天直接消失。这类问题最让人抓狂——电泳没跑错，胶也凝了，就是染不出来。大概率，问题出在染料浓度和染色环节。下面按「快速排低级错误—分流程系统查—进阶疑难」三段走，把预混浓度、泡染时间、脱色、成像参数一并拆开讲。照着做，多数情况20分钟内能定位。
第一步：先花两分钟排掉低级错误
这四个错误占了染色失败的一半，别急着换染料，先看这里。
1. 染液用了五六次还在用？ 染液每染一块胶，染料就被DNA消耗一部分，见光还会分解。重复使用超过3次，灵敏度直接掉一半。直接换新染液，EB用0.5 μg/mL，GelRed用3×。
2. 制胶时预混染料加错倍数？ EB终浓度0.5 μg/mL（10 mg/mL母液按1:20000加），GelRed终浓度1×。加少10倍，胶里根本没有足够的染料分子嵌入DNA。
3. 上样量本来就不够？ 100 ng以下的条带在常规胶上就是弱信号。先补一个200 ng对照孔，确认是样品太少还是染色问题。
4. 脱色泡过头了？ 水洗超过20分钟，弱条带信号肉眼可见地掉。改成1×TAE或去离子水洗10分钟就够。
第二步：按实验流程分四段系统排查
模块A：制胶与预混（第1—3步）
1. 预混染料浓度不足或分布不均
现象：整块胶所有条带都弱，连marker也比平时暗。原理很直接——预混染料在电泳过程中会随DNA一起迁移，浓度不够时DNA结合位点没饱和，荧光自然上不去。解决：按终浓度0.5 μg/mL EB或1× GelRed重新配胶，倒胶前摇匀30秒，别让染料沉在底部。验证：同一批样品做一块1×和一块2×的对比胶，信号有明显差异就说明原来浓度不够。
2. 染料加入时胶液温度太高
现象：同一批胶，越往后倒的越暗。琼脂糖刚煮沸就加染料，胶液温度超过90°C，部分荧光染料直接降解。冷却到60—65°C再加，手感是瓶壁不烫手、胶液仍流动。加完摇30秒再倒。验证：测同一批胶前后两块，亮度差超过30%就是温度问题。
3. 凝胶浓度和片段大小不匹配
现象：小片段弥散成一团，信号被稀释。0.8%的胶跑100 bp以下的片段，DNA扩散严重。小于200 bp用1.5%—2%琼脂糖，电压降到80—100 V，跑25分钟就停。验证：换高浓度胶后条带是否收窄变亮。
模块B：电泳环节（第4—6步）
4. 电压过高或电泳时间过长
现象：条带边缘发虚，整体亮度低。电泳场强控制在5—8 V/cm，100 V跑35—40分钟足够。跑太久，小片段扩散出胶或条带变宽，单位面积信号就弱了。看到溴酚蓝跑到胶的2/3处就停。验证：缩短10分钟重跑一块，比较条带锐度。
5. 电泳缓冲液反复使用
现象：条带歪、拖尾，染色偏弱。1×TAE重复用5次以上，pH升高、离子耗竭，DNA迁移异常，染料结合也受影响。每跑2—3次换新缓冲液，每次倒掉旧液别心疼。验证：新配TAE跑一块，看条带是否回正。
6. 上样缓冲液里去污剂浓度太高
现象：整孔条带弱，孔底还发亮。SDS等去污剂会竞争染料结合位点。换6× loading buffer，SDS终浓度控制在0.1%以下。验证：同一份DNA用新旧缓冲液平行上样。
模块C：染色操作（第7—9步）
7. 泡染时间不足
现象：胶表面亮、内部暗，切开看截面更明显。EB泡染要15—30分钟，GelRed用3×染液泡20—30分钟。只染5分钟，染料只进了表层。摇床50 rpm室温染30分钟，确保染液没过胶面。验证：染10分钟和30分钟各取半块胶对比。
8. 染液体积不够或浓度配错
现象：胶下半部分比上半部分暗。小胶至少30 mL染液，标准10×10 cm胶用50 mL，必须完全没过。EB工作液0.5—1 μg/mL，GelRed 3×，配完当天用。验证：量一下染液体积是否覆盖胶面1—2 mm。
9. 脱色过度或容器吸附染料
现象：新配的染液第一批就弱。GelRed、SYBR类染料容易被聚苯乙烯盒吸附，换聚丙烯盒或玻璃盒。脱色用1×TAE或去离子水，10—15分钟封顶，自来水里的余氯会淬灭荧光。验证：换盒后新配染液染一块标准marker，看信号是否恢复。
模块D：成像参数（第10—12步）
10. 激发波长不匹配
现象：条带暗、背景反而高。GelRed和SYBR Safe最佳激发在470 nm蓝光或302 nm紫外，用365 nm手持紫外灯照，激发效率低一大截。确认成像仪光源，UV透射用302 nm档。
11. 曝光和滤光片没调对
现象：手机拍出来白茫茫一片。UV下必须加橙红滤光片，曝光1/8—1/4秒先试拍。没有滤光片，背景光直接压过条带信号。验证：同一块胶换滤光片前后各拍一张。
12. 胶太厚
现象：条带中间暗、边缘清楚。胶厚超过8 mm，紫外吸收强、染色不均。制5—6 mm的薄胶，倒胶量按模具面积算，10×10 cm模具倒50 mL左右刚好。
第三步：进阶疑难，常规招数不管用时看这里
情况一：小于100 bp的片段，怎么染都弱。 片段小，染料结合位点本来就少，扩散还快。方案：2%琼脂糖、80 V低压跑、上样量提到300 ng、泡染延长到45分钟。还不行就换SYBR Gold，灵敏度比EB高一个数量级，代价是必须用蓝光成像。
情况二：高盐或含蛋白的样品染不上。 盐浓度超过100 mM会降低EB荧光，蛋白还会在孔底拖尾。现象是条带弱、孔底发亮。把样品用TE稀释5倍再上样，或者过个脱盐柱。验证：稀释前后平行上样，看信号是否恢复。
情况三：染料母液反复冻融后失效。 GelRed母液冻融3次以上荧光明显下降。现象是同一浓度、新旧染液差异巨大。母液分装成小份，4°C避光保存，别反复冻融。验证：新旧染液各染半块胶，一眼就能看出来。
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