来源：蛋白纯化疏水层析盐析温度控制（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
同样的柱子，同样的样品，上周还有60%纯度，这周连峰都找不到了。你大概率是同时踩到了盐析和温度这两条雷。疏水层析（HIC）是纯化流程里对温度最敏感的一步：高盐上样、低盐洗脱，中间的每一个 mol/L 和每一个 °C 都在改变蛋白表面的疏水补丁。这篇按上样前、结合、洗脱、收集四段，把失败现象逐条对到具体参数上，照着走一遍，基本能定位到问题出在哪。
第一步：先别怀疑方法，这几处低级错误最要命
1. 硫酸铵加完没调 pH。 硫酸铵固体溶进缓冲液会把整瓶 pH 往下拽 0.3–0.6，蛋白正好落到等电点附近就沉了。解决办法：配好 1.2 M 硫酸铵缓冲液后，用氨水调回目标 pH，pH 计实测，别信理论值。
2. 加盐后没离心就上柱。 高盐一进去蛋白就析出，直接堵筛板，柱压从 0.3 MPa 飙到 1.5 MPa。解决办法：加完盐 4°C 静置 30 分钟，12000 rpm 4°C 离心 20 分钟，再过 0.22 µm 滤膜。
3. 拿 NaCl 当盐析盐用。 HIC 要的是盐析效应，1 M NaCl 对多数蛋白几乎不起结合作用，全流穿。解决办法：换硫酸铵 1.0–1.5 M，或柠檬酸钠 1.0–1.2 M，或硫酸钠 0.8–1.0 M。
4. 平衡体积不够。 1 mL 柱只走 1 mL 平衡液，柱内还是 20 mM 低盐。解决办法：至少 5 CV，也就是 5 mL，流速 1 mL/min。
第二步：分维度系统排查
A. 上样前：盐析这一步就出岔子
1. 加盐速度太快，溶液瞬间发白。
现象：母液一滴进去，局部立刻浑浊。
原理：局部盐浓度过高，把蛋白表层的水化层剥掉，疏水补丁直接抱团，这是不可逆沉淀。
解决：用 3.5–4 M 硫酸铵母液，4°C 下边搅边用蠕动泵滴加，30 分钟把终浓度加到 1.2 M，加完继续搅 30 分钟。
验证：12000 rpm 4°C 离心 20 分钟，看管底沉淀量；沉淀明显就说明盐加猛了，把终浓度降到 1.0 M 重做。
2. 盐浓度“差不多就行”。
现象：批与批之间流穿比例来回飘，重复性差。
原理：HIC 的结合窗口很窄，0.9 M 和 1.2 M 硫酸铵能差出 30% 结合率。
解决：固定用同一支电导率笔测母液，把 mS/cm 数值写进实验记录，别只写 mol/L。
验证：同一批样品分别用 1.0、1.2、1.5 M 硫酸铵跑三根 1 mL 小柱，流穿液各留 50 µL 跑 SDS-PAGE，挑流穿条带最弱的那一档。
B. 上样与结合：温度是隐形变量
3. 室温配液、冷室过柱。
现象：冷室里跑，流穿明显变多，洗脱峰矮了一半。
原理：疏水作用靠熵驱动，温度越高疏水结合越强；从 25°C 降到 4°C，结合常数能掉好几倍。
解决：全程锁死一个温度。要么全 4°C，缓冲液提前一天进冷室，柱子平衡 5 CV；要么全程 20–25°C。别一半一半。
验证：同一批样品 4°C 和 25°C 各跑一次，流穿液并排跑胶，条带差多少一眼就看出来。
4. 结合温度太低，柱上压根没结合。
现象：几乎全流穿，洗脱段平得像条直线。
原理：部分蛋白