来源：蛋白结晶不出晶核筛选试剂优化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
筛了十几块板，液滴清得像纯水，一点沉淀都没有。这大概是结晶间里最让人抓狂的画面。你换了蛋白批次，重配了试剂盒，结果还是空白。问题往往不在蛋白本身，而在筛选试剂的浓度窗口、pH区间、离子强度和温度这几件事上错位了。这篇教程按"低级错误—系统维度—进阶疑难"三层往下拆，每一步都给判断依据、操作参数和验证动作。照着做，绝大多数"完全无晶核"的板子都能找到原因。
第一步：先花20分钟查这几件"蠢事"
别急着上梯度。八成"完全不成核"就错在这几个地方。
1. 蛋白浓度报错了。你手里到底是5 mg/mL还是15 mg/mL？BCA和A280经常差20%以上。低于2 mg/mL推不到过饱和，高于40 mg/mL直接出无定形沉淀。做法：A280测三次取均值，用同批透析液做空白。
2. 试剂盒母液配错或过期。PEG 3350放两年会吸水，实际浓度偏低。硫酸铵母液长霉也常见。直接开新盒，或拿折射仪查PEG实际浓度。
3. 液滴没封住。坐滴板池液只加50 µL，两周就干掉。池液至少500 µL，密封膜一次压实，别用反复揭过的膜。
4. 温度记错。标注18°C结果放的是4°C冷室。4°C下PEG体系黏度大，成核速率能慢好几倍。
第二步：分维度系统排查
板子还是干净？按下面五条走。
1. 蛋白样品本身
现象：所有pH、所有沉淀剂都无沉淀，液滴完全透明。
原理：蛋白可能已聚集或降解，可溶性单体浓度不够。聚集体不参与成核，只会让你看到"清亮"。
解决：
- 跑还原/非还原两块SDS-PAGE。非还原胶出现高分子量弥散带，就是二硫键聚集。
- 加1-5 mM DTT或TCEP，4°C过夜。
- Superdex 200过一次，取单体峰浓缩到10 mg/mL再筛。
- 缓冲液换成20 mM Tris pH 8.0 + 150 mM NaCl，避开高盐储存液。
验证：筛板上出现"重沉淀"而非清亮，说明蛋白浓度到位了。
2. pH区间
现象：某几列出现轻微雾状，但不出晶核。
原理：pH决定蛋白表面电荷。等电点附近溶解度最低。错过pI好几个单位，永远推不过成核能垒。
解决：
- 先做pH梯度：0.1 M柠檬酸pH 3.5–5.5、MES pH 5.5–6.5、Tris pH 7.0–9.0，每0.5一个点。
- 沉淀剂固定，比如20% PEG 3350。
- 计算pI，把pH窗口压在pI±1以内。
验证：24 h内看到相分离（液滴发雾），48 h内出现微晶或针状。
3. 沉淀剂种类和浓度
现象：PEG筛完十几块板，全是清液。
原理：PEG靠体积排斥推高有效浓度，盐靠离子屏蔽。类型选错等于没加。
解决：
- 先跑Index或PEG/Ion，覆盖PEG 400/1000/3350/8000，浓度10–30%（w/v）。
- 硫酸铵1.0–3.0 M、柠檬酸钠0.5–1.5 M作盐类补充。
- 关键动作：在"刚好出现沉淀"的条件往下降5%沉淀剂，那才是成核窗口。
- 配2倍母液，0.22 µm滤膜过滤，别涡旋。
验证：悬滴法24孔板复筛，池液500 µL，液滴2 µL+2 µL，18°