来源：无细胞蛋白表达量低能量再生（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做CFPS最让人抓狂的场面：体系配好，30°C摇4小时，产量只有几十µg/mL，比空载体还低。第一反应通常是提取物不行、模板不好，于是换批次、重设计，折腾两周还是老样子。别急着甩锅给提取物。八成问题出在能量再生系统上——ATP在30分钟内就被耗空，后面三个半小时全是无效孵育。这篇教程按"低级错误→分模块排查→进阶疑难"三层走，把每个原因的判断、验证、解决动作写清楚。
第一步：先花5分钟排除低级错误
1. 磷酸肌酸或PEP忘了加，或者CPK冻融超过3次已经失活。直接换一支新分装的CPK，按0.1 mg/mL补进去，重跑。
2. 葡萄糖、丙酮酸或PEP母液浓度算错，实际终浓度低于10 mM。拿移液枪回查母液，重新配20 mM工作液。
3. 镁离子加的是MgCl₂而不是Mg-谷氨酸，高氯离子直接抑制翻译。换成10 mM Mg-谷氨酸。
4. 反应管没压矿物油，30°C下体积蒸发超过15%。加50 µL mineral oil封顶。
第二步：按流程分维度系统排查
1. 能量底物本身：ATP初始量够不够，再生底物会不会提前耗尽
现象：前30分钟表达正常，1小时后曲线直接压平，SDS-PAGE上看不到目标带加深。
原理：CFPS里每条肽链延伸消耗约4个ATP当量，1.2 mM ATP在无再生时只撑20-30分钟。
解决：把ATP提到1.75 mM，同时补20 mM磷酸肌酸。走糖酵解路线的话，葡萄糖给到20 mM，别超过30 mM，否则乙酸积累压pH。
验证：每30分钟取1 µL测荧光素酶发光，或用NADH偶联法测ATP残留。看到ATP在60分钟内掉到0.2 mM以下，就说明再生没跟上。
2. 再生酶活性：CPK、丙酮酸激酶是不是在"假工作"
现象：ATP加够了，再生底物也加了，产量还是低，体系pH在4小时内掉0.5。
原理：CPK催化肌酸磷酸+ADP→肌酸+ATP，最适pH 7.0-7.5，Mg²⁺低于5 mM时活性掉一半。PEP路线则会被体系里残留的磷酸酶水解，底物白给。
解决：CPK按0.05-0.1 mg/mL加，Mg²⁺保证8-12 mM。用PEP路线时，先65°C热处理提取物10分钟灭内源磷酸酶，再补PEP。
验证：取20 µL反应液，加CPK和肌酸磷酸反向测肌酸生成速率；或者跑一张薄层色谱看PEP残留。
3. 离子与辅因子：Mg²⁺、K⁺、NH₄⁺配比错一个就塌
现象：整个体系浑浊，离心后有白色沉淀，上清产量极低。
原理：Mg²⁺和磷酸根、