来源：甲基化测序转化率低重亚硫酸盐（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
你跑完甲基化测序，打开比对报告一看：非 CpG 位点的 C→T 转化率只有 92%。标准在哪？99% 以上。要么整批数据报废，要么下游甲基化 calling 全是假阳性。先别骂试剂盒。转化率低的锅，八成出在样本质量、变性条件或者操作细节上。这篇教程按“低级错误—流程分模块—疑难杂症”三层往下捋。每一步都给判断方法、验证手段和具体参数。照着做，大概率能把转化率拉回 99.5%。
第一步：先看四个新手坑
1. DNA 上样量超标。 你以为多加点保险，实际上 1 µg 以上的 DNA 在 60°C 孵育时会局部中和亚硫酸氢盐的 pH。直接降到 200–500 ng，FFPE 样本 100–200 ng。
2. 试剂盒拆封太久。 亚硫酸氢盐溶液配好后室温放超过 1 周，转化效率肉眼可见地掉。看配制日期，超过 3 个月直接换新批次。
3. DNA 里残留 EDTA 或乙醇。 提取完直接上样，EDTA 浓度超过 0.5 mM 就会螯合亚硫酸根离子。用 TE 溶解的样本先做一次乙醇沉淀，或换无 EDTA 的洗脱液。
4. 热盖温度没设或设错。 盖温不够，管内液体蒸发富集到管壁，实际反应浓度全乱。设 105°C 热盖，或者加一滴矿物油。
第二步：按流程分模块系统排查
转化率低不是一个原因，是五个环节串起来的结果。按实验顺序逐段查。
1. 样本前处理：DNA 状态决定上限
现象：同一批试剂盒，别的样本转化率 99.5%，你这几个只有 93%。
原理：亚硫酸氢盐只能作用于单链 DNA 上的胞嘧啶。DNA 如果断裂严重、有蛋白残留或者高度交联，变性后链会回缩，C 位点被埋在双链或二级结构里，反应根本碰不到。
解决：跑 1% 琼脂糖凝胶看完整度。主带在 10 kb 以上、无弥散 smearing 才算合格。蛋白残留用蛋白酶 K 55°C 消化 1 小时，柱纯化后再上样。取 200 ng 做起点。
验证：取 50 ng 样本跑 Agilent 2100，DIN 值大于 7。DIN 低于 5 的 FFPE 样本别硬做，换降解修复试剂盒。
2. 变性步骤：温度和时间都要够
现象：所有样本转化率齐刷刷低于 95%，包括对照 lambda DNA。
原理：经典方案是 95–99°C 变性 5–10 分钟，让双链解开。温度低了链打不开，时间短了只解开一部分。但超过 99°C 或超过 10 分钟，DNA 片段化加剧，短片段在后续柱纯化里丢掉，你算转化率的分母就变小了。
解决：按试剂盒走。EZ DNA Methylation-Gold 用 98°C 10 分钟变性，