来源：毛细管等电聚焦峰展宽两性载体（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑cIEF，最怕的不是没峰，是峰宽到像小山包。pI分不开，重复性还差，你以为是蛋白坏了吗？多数时候，问题藏在两性载体、样品基质和聚焦条件里。这篇按实操流程拆：先查低级错误，再按样品、梯度、涂层、聚焦、mobilization分维度排查，文末讲两性载体批次、蛋白-载体加合这类进阶坑。给你能直接上手的体积、时间、温度和电压参数。
第一步：快速排查低级错误
1. 样品盐浓度太高。电流飙到30 µA以上、聚焦慢、峰宽，就是它。用10 kDa超滤管换液，4°C、14,000×g、10 min，换到0.1% CHAPS，测电导<50 µS/cm。
2. 两性载体加错或过期。pI marker也宽、梯度塌，别怀疑蛋白。换新批号，工作浓度2–4%。目标pI 5–8就选pH 5–8窄范围，别只用pH 3–10。
3. 毛细管没洗干净或涂层失效。峰漂、拖尾，直接看柱子。0.1 M NaOH冲5 min，水冲2 min，再用运行缓冲预平衡；涂层柱失效就换新。
4. 电极液放反或液面有气泡。无峰、峰畸变，先查这里。阳极20 mM H3PO4，阴极20 mM NaOH，排气泡，液面齐平。
第二步：分维度系统排查
1. 样品基质与蛋白状态
现象：峰宽、尖刺、回收率低。
原理：高盐