来源：CRISPR文库构建覆盖度低（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
文库测完序，三分之一sgRNA没出现，丰度差几百倍。这几乎每个做CRISPR筛选的人都撞过。别急着怀疑试剂，覆盖度低极少是"运气差"，多数时候是某一环的瓶颈被你忽略了。这篇按实验流程拆成6个模块，每块给你现象、原理、可直接照做的参数和验证动作。走一遍，基本能定位到卡在哪一步。
第一步：先花20分钟排除低级错误
这几个坑不花钱，换个操作就能解决。
1. Oligo干粉没溶透。开盖前不离心，粉末粘管盖，实取浓度可能只有标称30%。解决：12000 g离心1分钟再开盖，加TE（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）至100 µM，50°C水浴10分钟，涡旋10秒，再离心。
2. 用化学感受态建库。DH5α化学转化约1×10⁶–10⁷ cfu/µg，电转能到1×10⁹–10¹⁰，差1000倍，库容量直接塌。解决：换电转感受态，0.1 cm电击杯，1.8 kV、200 Ω、25 µF。
3. 复苏时间不够。只摇30分钟，抗性基因还没表达，上板就死。解决：加1 mL SOC，37°C、220 rpm摇1小时再涂。
4. 板子涂太少。10,000条sgRNA按100–1000×覆盖算要10⁶–10⁷个克隆，一块15 cm板最多长2×10⁶。解决：倒推板数，至少4–6块15 cm板。
第二步：分维度系统排查
① 起始oligo池：先判断是"合成缺失"还是"采样丢失"
现象：缺失的sgRNA随机散落、无GC偏好，重复实验缺的也是同一批——固定缺失，说明池本身有问题；反之缺的每次都不一样，大概率是后面采样不够。
原理：芯片合成每条oligo产率不均，长度超过150 nt截断率明显上升，脱盐纯化残留的短片段会在PCR里抢模板。
解决：订PAGE或HPLC纯化pool，单条长度压到150–200 nt；收到后先qPCR定量，别只信Nanodrop。
验证：取1 ng pool直接做NGS（input pool sequencing），看原始池覆盖度。这一步花不了多少钱，能省掉后面全部扯皮。
② 池PCR：循环数是双刃剑
现象：胶上主带旁有弥散，或测序发现AT-rich sgRNA异常富集。
原理：每多一轮循环，偏倚被放大一次；超过20轮，GC偏好和重组都上来了。模板低于1 ng则随机丢失加剧。
解决：50 µL体系，模板10 ng pool，Q5或Phusion 0.5 µL，98°C 10 s、65°C 30 s、72°C 30 s，跑15–18轮。做4–8管50 µL再合并，别图省事搞单管500 µL——大体系热传导不均，偏倚更重。
验证：取5 µL跑2%琼脂糖胶，主带单一无杂带；同时设不同循环数（12/15/18）小试，选刚出主带的最少轮数。
③ 酶切与组装：空载背景最容易骗过你
现象：平板菌落数还行，但菌落PCR一半是空载。
原理：载体双酶切不完全导致自连；Gibson insert:vector摩尔比失衡，vector过量会挤掉insert。
解决：切10 µg载体，37°C酶切3小时，加1 µL rSAP 37°C处理30分钟去磷酸化，胶回收。组装按insert:vector摩尔比3:1，2×Gibson mix，50°C孵育60分钟。
验证：必设阴性对照（只加vector不加insert），对照板菌落应少于实验板的5%。超了就是载体没切干净。
④ 电转化：盐和体积是隐形杀手
现象：电击打火，或时间常数掉到2 ms以下，菌落寥寥。
原理：Gibson mix里盐浓度高会击穿样品池；DNA超过100 ng会提高打火概率。
解决：组装产物先透析（0.025 µm滤膜，Milli-Q水漂浮20分钟）或乙醇沉淀去盐；每次电转加2–5 µL、DNA总量控制在50–100 ng；时间常数应落在4.5–5.5 ms。
验证：取1 µL复苏液做10倍梯度稀释涂板，乘稀释倍数反推总克隆数。
⑤ 扩增：最隐蔽的瓶颈
现象：转化后覆盖度尚可，maxi prep做完再测序，覆盖度掉了一截。
原理：液体培养就是一次竞争。接种量不足时，生长快的克隆被稀释放大，慢的克隆直接归零。
解决：刮板菌直接接种到500 mL LB（2 L摇瓶），起始OD₆₀₀不低于0.05；37°C、220 rpm摇到OD₆₀₀ 0.4就收，别过夜。过夜培养是覆盖度杀手。
验证：扩增前后各留一份样品做NGS，比Gini index。涨了0.05以上，就是扩增环节出的问题。
⑥ 测序与分析：别把测序误差算到建库头上
现象：算出来覆盖度60%，但重复建库结果一致。
原理：测序深度不足（每条sg