来源：CRISPR编辑效率低脱靶检测优化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
转染了3天，T7E1没切带，Sanger峰图一塌糊涂；换高保真Cas9后效率又掉到5%以下，GUIDE-seq结果像噪声山。别急着换课题。这篇把CRISPR效率低和脱靶检测优化拆成可操作排查表：湿实验、测序、生信三条线，覆盖sgRNA设计、RNP电转、HDR增强、T7E1/TIDE/amplicon NGS、GUIDE-seq/CIRCLE-seq。照着做，多数坑当天能定位。
第一步：快速排查低级错误
- sgRNA序列拿错链？把spacer与PAM反向互补核对，别直接抄数据库负链。
- Cas9或sgRNA降解？RNP现混现用，37°C孵育20分钟后立刻冰上，避免反复冻融。
- 电转参数照搬？HEK293T用1×10^5细胞配1 µg Cas9蛋白+100 pmol sgRNA，程序CM-137；iPSC换DS-150并预热培养基。
- 检测时间太早？HEK293T转染后72小时收样，iPSC等到96-120小时，48小时前大概率看不到indel。
第二步：分维度系统排查
1. sgRNA活性低
现象：T7E1无切割带，TIDE显示indel <5%。
原理：spacer GC极端、二级结构、PAM附近SNP都会让Cas9结合差。
解决：把spacer改成17-18 nt，GC控制在45-60%，避免poly-T；换2-3条sgRNA，靶向外显子前50%。U6启动子时，5'端保证G或加G。
验证：体外切割