来源：DNA Lab Space 实验教程 | 编译：DNA Lab Space
做甲醛变性胶RNA电泳，最怕的不是没有条带，而是辛辛苦苦跑出来的胶上糊成一片、条带拖尾、连18S/28S都分不清。你以为是RNA降解了，其实可能是缓冲液配错、甲醛pH不对、电压太高，甚至上样量太多。本文按照“低级错误→系统模块→进阶疑难”三个层次，帮你一步步把弥散问题查清楚，每步都有具体参数和验证方法。
第一步：快速排查低级错误
1. 样品RNA降解了：电泳前用紫外分光光度计测A260/A280，但降解样品OD值不一定难看。更直接的办法是另跑一块1%普通琼脂糖胶（非变性）快速看：如果RNA已经降解成弥散小片段，那问题出在提RNA环节，不是胶的锅。解决：重新提RNA，全程冰上操作，用DEPC水溶解。
2. 甲醛凝胶缓冲液用错浓度：甲醛变性胶需要1×MOPS缓冲液（20 mM MOPS，5 mM醋酸钠，1 mM EDTA，pH 7.0），很多人直接用TAE/TBE，或者稀释错了。解决：按配方现配现用，MOPS母液避光保存，pH必须是7.0±0.1。
3. 甲醛没调pH或者放太久：市售甲醛是37%溶液，长时间存放会氧化成甲酸，pH降到4以下，直接破坏RNA并导致条带弥散。解决：用新鲜甲醛，使用前测pH，如果<4.0就弃用；最好加入适量NaOH调回pH 7.0再配胶。
4. 上样量太大：总RNA上样超过15 μg，或者mRNA超过2 μg，加样孔超载会导致条带过宽、拖尾，甚至相邻泳道互相污染。解决：总RNA上样量控制在5–10 μg（20 μL体系），加样量体积不超过孔容积的50%。
第二步：分维度系统排查
下面按样品制备、凝胶配制、电泳条件、染色观察四个模块展开，每个原因都给出“现象→原理→解决→验证”的逻辑。请对照你的实验记录逐条排查。
模块1：样品制备环节
原因1：RNA在甲醛上样缓冲液中变性不彻底
- 现象：18S和28S条带之间有大量背景弥散，且28S条带上方出现高迁移率拖尾。
- 原理：标准变性体系是：RNA样品5 μg + 甲醛上样缓冲液（含62.5%去离子甲酰胺、1.14 M甲醛、溴酚蓝、甘油），在65℃孵育15 min。如果温度不足、时间不够，或甲酰胺/甲醛浓度被稀释，RNA二级结构不能完全打开，导致迁移率异质，跑出“云雾状”弥散。
- 解决步骤：
1. 按下面配比混合：RNA 5 μL（含2 μg）, 10×MOPS 2 μL，甲醛 3.5 μL，甲酰胺 10 μL，上样染料 1 μL，DEPC水补至20 μL。
2. 65℃金属浴孵育15 min，然后立即冰浴3 min，短暂离心后上样。注意不要把样品放在冰上超过10 min，否则甲酰胺会部分再结晶。
- 验证方法：取同一份RNA，分别用55℃/60℃/65℃处理15 min，跑胶对比。65℃处理的样品弥散背景显著减少，18S/28S分辨率最佳，说明变性温度是关键。
原因2：RNA样品含有残留蛋白、苯酚或盐离子
- 现象：所有泳道都有从加样孔到前沿的连续“拖尾”，且染料前沿也扭曲。
- 原理：残留蛋白会与RNA结合，使其净电荷和分子大小发生改变；高浓度盐离子（>100 mM NaCl）会干扰电导率，使局部电场不均，条带被拉扯成弥散状。尤其是用Trizol提完后，乙醇沉淀未充分洗涤，或氯仿残留。
- 解决步骤：
1. 重新沉淀RNA：加1/10体积的3 M醋酸钠（pH 5.2）+2.5倍体积无水乙醇，-80℃放置30 min，4℃ 12000 g离心15 min。
2. 用70%乙醇洗涤沉淀两次，每次静置1 min，轻轻吸掉上清，室温干燥5 min（不要过度干燥）。
3. 用DEPC水溶解后测A260/230，比值应>2.0；如果<1.8，说明有盐/酚残留。
- 验证方法：取纯化前后的RNA各2 μg上样，若纯化后弥散明显改善，则确认污染是主因。
模块2：凝胶配制环节
原因3：琼脂糖凝胶浓度与甲醛不匹配
- 现象：条带整体偏慢，压缩在加样孔附近，但孔下方有很宽的淡红色拖尾（EB染色时）。
- 原理：甲醛变性胶常用1.2%–1.5%琼脂糖（对应200 bp–10 kb RNA）。浓度过低，凝胶孔径太大，小片段跑得过快，大片段被压缩；浓度过高，小片段无法进入胶体，形成孔口堆积。另外，甲醛会轻微降低琼脂糖的机械强度，相同浓度下比普通胶更软。
- 解决步骤：
1. 按RNA大小范围选择：一般总RNA用1.2%琼脂糖，mRNA用1.0%–1.2%，小于500 nt的RNA用1.5%–2.0%。
2. 准确称量琼脂糖，用1×MOPS配胶，微波加热溶解后冷却至60℃再补加甲醛（终浓度2.2 M，即每100 mL凝胶加5.4 mL 37%甲醛），混匀倒板。
3. 倒板后室温凝固30 min，不要放4℃，否则胶体变脆易碎。
- 验证方法：做1.0%、1.2%、1.5%三块平行胶，用同一RNA样品电泳，观察18S/28S分离度，选择条带最锐利、弥散最少的浓度。
原因4：凝胶缓冲液体系pH不对或离子强度异常
- 现象：溴酚蓝迁移前沿出现“波浪形”，条带倾斜，RNA电泳方向偏斜且条带弥散。
- 原理：MOPS缓冲液在电泳过程中pH会向正极漂移（阳极产酸），如果缓冲液不新鲜或未循环，pH下降会导致甲醛从RNA上解离，RNA部分复性，迁移率紊乱。同时，离子强度太低（比如误用了0.5×MOPS）会使电阻增大，产热增加，造成胶内温度梯度。
- 解决步骤：
1. 电泳槽内使用新鲜1×MOPS缓冲液，液面要没过凝胶约2 mm，与胶面齐平或略低都可，但不能没过加样孔顶部。
2. 对于长时间电泳（>3 h），必须把缓冲液在两个槽之间循环，泵速5–10 mL/min；如果不具备循环条件，每跑1 h暂停，吸出阳极槽缓冲液换到阴极槽（手动循环）。
3. 电泳结束后，再用染色前的1×MOPS缓冲液冲洗凝胶表面，去除残留甲醛，避免影响核酸染色。
- 验证方法：用pH试纸测电泳前后阳极槽缓冲液，pH变化应<0.5；若变化大于1，说明缓冲液容量不足，需要换新并缩短电泳时间。
模块3：电泳条件环节
原因5：电压过高导致产热和变性失败
- 现象：条带扩散宽大，但迁移距离符合预期；胶体边缘有波浪状弯曲，甚至加样孔变形。
- 原理：甲醛变性胶适宜电压为5–7 V/cm（电极间距离），若按10 V/cm跑，功率升高导致胶内温度上升，盐酸甲醛的跨膜平衡被破坏，RNA结合甲醛的可逆变性反应逆转，同时电泳速度过快使大片段来不及穿出孔就部分复性。典型结果是条带变宽、弥散。
- 解决步骤：
1. 计算电压：用正负电极间实际长度（不是胶的长度）。比如槽长15 cm，电压设为75–100 V，绝不能超过120 V。
2. 在4℃冷库中电泳可适当提高电压到8 V/cm，但需预冷缓冲液至4℃。
3. 使用高电压时，把电泳槽放在冰水浴中，并每30 min监测一次电流，电流超过150 mA说明产热严重，需降档。
- 验证方法：同一块胶，先跑100 V，再跑60 V对比。60 V下如果条带更锐利，弥散减少，说明电压是主因。推荐标准条件：1.2%胶，8 V/cm，跑2 h左右，直到溴酚蓝迁移至胶的2/3处。
原因6：RNA上样量不足，染色后非特异性背景被放大
- 现象：条带很浅，但背景却整体发红，似乎有大量小片段弥散，看起来像“连成一片”。
- 原理：甲醛变性胶中如果上样量太低（<1 μg），EB或SYBR Gold染色后，为了拍照不得不增加曝光强度，或延长染色时间，结果背景中未结合的染料和降解产物被过度放大，误判为条带弥散。上样量过高则导致前文所述“过载弥散”。
- 解决步骤：
1. 对于EB染色，推荐上样量：总RNA 3–5 μg，mRNA 0.5–1 μg。
2. 换用SYBR Gold（1:10000稀释于1×MOPS中）染色30 min，灵敏度是EB的10倍，可有效降低背景。
3. 拍照时避免过度调高增益，设置合适的曝光时间，最好以空白泳道背景为参考。
- 验证方法：梯度上样（1, 3, 5, 10 μg）跑一块胶，找到信噪比最佳的浓度。理想状态是18S/28S清晰，背景均匀，无加样孔处残留发光。
模块4：染色与成像环节
原因7：染色时间过长或未脱色，造成表观弥散
- 现象：胶体整片亮红，条带和背景对比度极低，像是“全胶弥散”。
- 原理：EB染色（0.5 μg/mL）时间超过60 min，染料非特异性结合到琼脂糖骨架和碎片RNA上；甲醛凝胶中残留甲醛也会与EB结合形成荧光复合物，造成背景荧光。甲醛胶如果不经过水洗直接拍照，甲醛本身在UV下有微弱吸收，也会加剧背景。
- 解决步骤：
1. 电泳结束后，先用DEPC水或1×MOPS漂洗凝胶两次，每次5 min，去除甲醛。
2. 再用0.5 μg/mL EB水溶液染色20–30 min（避免用1 μg/mL长时间染）。
3. 染色后用水脱色20 min，换水一次。
- 验证方法：染色后在同一条件下拍照记录，脱色后再拍一张。如果脱色后的弥散区域明显减少，说明染色操作是问题。
第三步：进阶疑难问题
疑难1：RNA条带看似弥散，但18S/28S位置其实清晰，只是中间有“云带”
- 这种情况往往来自基因组DNA污染，因为基因组DNA在甲醛胶中会形成高分子量弥散拖尾，与RNA弥散重叠。验证：在同一块胶上，加一份DNase I消化后的RNA样品对比。若消化后云带消失，说明需重新做DNase消化（每10 μg RNA加2 U DNase I，37℃ 30 min，然后EDTA灭活）。
疑难2：甲醛凝胶pH太低导致RNA部分降解但肉眼不可见
- 甲醛母液用久了pH降低，配出来的胶虽然还是透明，但RNA在跑胶过程中会被酸水解，表现为18S/28S下移、整体弥散。进阶排查：先用pH试纸测胶冷却后的表面pH——应接近7.5。如果低于7.0，则用10 M NaOH调节甲醛至7.0后再配制。验证：使用新开封甲醛重配胶，旧胶/新胶同批样品对比，弥散消失即确认。
疑难3：电泳后条带锐利，但一拍照就变模糊
- 这是成像问题，不是电泳问题。甲醛胶中残留的MOPS会在EB荧光下产生紫外吸收，导致条带散射。解决：拍照前将凝胶完全浸入水中30 min，或者用白光转换板配合EB滤镜拍照，而不是直接用紫外透射台。验证：把胶从紫外台挪到白光台上，对比分辨率。
避坑总结+实操建议
1. 核心结论：任何一条电泳效果的异常，先排除RNA是否降解，再考虑胶和缓冲液。 不要一上来就怀疑实验方法，先跑一块普通琼脂糖胶快速鉴定RNA完整性，这是最快、最便宜的排查手段。
2. 核心结论：甲醛浓度和MOPS缓冲液的pH是凝胶的灵魂。 每次必须现配缓冲液，甲醛使用前测pH，电泳时间控制在2小时内，电压不要超过8 V/cm。
3. 核心结论：上样量宁少勿多，染色时间宁短勿长。 5 μg总RNA足够看到清晰18S/28S，染色30分钟足够，拍照前务必脱色。
- 日常好习惯1：建立“试剂开瓶日历”，在甲醛瓶和MOPS母液瓶上标注开封日期，超过3个月就换新的。DEPC水母液每月更换。
- 日常好习惯2：每次跑胶都带一个“标准RNA marker”或者用之前验证过的RNA作为阳性对照，这样能快速区分是样品问题还是系统问题。
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