来源：DNA Lab Space 实验教程 | 编译：DNA Lab Space
摇菌摇了16个小时，菌液浑浊得像牛奶，结果质粒大提后一测浓度只有20 ng/μL——这种“努力全白费”的崩溃，几乎每个分子生物学家都经历过。其实质粒大提产量低，八成都不是试剂盒的锅，而是从菌株选择到菌体收集的前期细节出了问题。这篇教程会从最容易翻车的低级错误说起，再按“培养前—培养—收集—裂解—柱纯化”逐个模块排查，最后聊聊大质粒、低拷贝等进阶疑难。全程有具体浓度、转速和时间，照着调就能提上量。
第一步：快速排查低级错误
新手提不出质粒，先别急着怀疑试剂盒，90%都是这三个地方在捣鬼：
1. 忘加抗生素或抗生素失效：菌里没质粒，长得再多也是空壳。解决：新鲜配制抗生素，卡那霉素用终浓度30 μg/mL，氨苄青霉素用100 μg/mL；平板上挑单克隆后，液体培养要换新鲜母液。
2. 菌株/质粒弄混：把低拷贝质粒（如pBR322）当成高拷贝质粒来养，按常规体积收集，产量自然上不去。解决：做实验前查一遍质粒图谱，确认复制子是pUC还是pBR322、p15A。
3. 离心后倒掉沉淀：收集菌体时，一顺手把上清倒了，沉淀跟着飘走。解决：倒上清前先在灯光下照一下管底，看到白色/淡黄色沉淀后再动作；如果菌液太稀，宁可保留1 mL上清重新离心，也不要直接倒。
第二步：分维度系统排查
如果低级错误没问题，那就按实验流程从源头到终点逐段排查。下面每个原因都给出“现象→原理→解决→验证”的闭环思路。
1. 培养前：复制子决定了你的“天花板”
- 现象描述：同样的试剂盒、同样的操作，别人一提能得100 μg，你只有20 μg。
- 原理说明：质粒拷贝数由复制子决定。pUC/pMB1衍生型拷贝数在500–700，pBR322约20，pACYC约10。低拷贝质粒即使菌体再多，产量也有限。
- 解决步骤：查质粒图谱确认复制子类型；如果是低拷贝质粒，把培养体积从100 mL扩大到300 mL，或用氯霉素扩增：在OD600≈0.6时加入氯霉素至终浓度170 μg/mL，继续振荡培养16小时。
- 验证方法：取1 mL菌液同步做质粒小提，酶切后跑琼脂糖凝胶电泳，根据条带亮度粗判拷贝数是否正常。
2. 培养中：菌没长好，后面全白搭
- 现象描述：菌液看起来浑浊，但OD600只有0.6，或者培养超过18小时但沉淀很少。
- 原理说明：大肠杆菌在LB中生长效率一般，装太多液体会导致溶氧不足；营养耗尽后进入稳定期，质粒拷贝数不升反降，还会因细胞自溶释放核酸酶降解质粒。
- 解决步骤：使用LB或2×YT培养基；500 mL三角瓶装液量不超过125 mL，保证瓶壁挂液、通气良好；37 ℃，200–220 rpm培养12–16小时，不要超过18小时。收集前测OD600，高拷贝质粒应达到2–4，低于1就继续养或换用TB培养基（TB需另加甘油和磷酸盐缓冲液）。
- 验证方法：取菌液做梯度稀释涂板，数菌落数；或直接看离心后菌泥湿重，100 mL高密度培养液湿重应≥1 g。
3. 收集环节：菌体丢了再好的柱子也没用
- 现象描述：离心后沉淀很少，或者提完后电泳条带极浅。
- 原理说明：离心力不足、时间不够，会让部分菌体残留在上清；反复冻融菌体则会造成质粒泄漏，被胞内核酸酶降解。
- 解决步骤：4 ℃下6000×g离心15分钟（50 mL离心管可用8000×g离心10分钟）。弃去上清后，将离心管倒扣在吸水纸上30秒，用移液枪吸掉壁上残余液滴。收集好的菌体可暂时放-20 ℃，但最好用新鲜菌体，若必须冻存，要在-80 ℃且一周内使用，不要反复冻融。
- 验证方法：称沉淀湿重，100 mL菌液湿重低于0.5 g则说明收集环节损失过大；若沉淀呈红色或褐色，大概率是培养基残留，会抑制后续裂解。
4. 碱裂解：5分钟是生死线
- 现象描述：加P2后菌液久久不清亮，或中和后絮状物很少；洗脱液A260/280异常。
- 原理说明：SDS和NaOH的作用是破坏细胞膜并变性蛋白质和基因组DNA，但如果裂解时间过长（>5分钟），基因组DNA会彻底断裂，与质粒一起进入上清，反而污染产物；裂解时间太短则菌体未完全破裂，质粒释放不出来。
- 解决步骤：P1重悬菌体后，加入P2前先加RNase A（终浓度20 μg/mL，或直接用含RNase的P1充分混匀）。加P2后轻柔颠倒4–6次，室温静置不超过5分钟，尤其不要涡旋振荡。中和液P3加入后应看到白色絮状物（SDS与蛋白质、基因组DNA的复合物），混匀后冰浴10分钟，然后在4 ℃下12000–15000×g离心20分钟。
- 验证方法：离心后的上清应清亮透明；若浑浊，用0.45 μm滤膜过滤后再上柱。另外取10 μL上清跑胶，应看到明亮的前沿质粒条带，如果整个泳道都是弥散条带，说明基因组断裂污染。
5. 柱结合与洗脱：最后一步也最容易被骗
- 现象描述：上清清澈，但洗脱液中DNA浓度低于预期。
- 原理说明：结合缓冲液的盐浓度不足会导致质粒无法与硅胶膜结合；上样体积过大超过柱子结合量；洗脱体积太少或缓冲液pH错误则导致质粒仍留在膜上。
- 解决步骤：上柱前将上清与等体积的QBT平衡缓冲液（如含750 mM NaCl、50 mM MOPS，pH 7.0）混匀；分两次过柱，每次低转速（1000×g）离心2分钟，倒掉滤液。洗脱前向柱膜上滴加预热至65 ℃的洗脱液（10 mM Tris-Cl，pH 8.