来源：DNA Lab Space 实验教程 | 编译：DNA Lab Space
养细胞最怕什么？不是培养基污染发黄，不是血清质量波动，而是支原体——看不见、摸不着、不爆死亡、不飘黑点，却悄悄改变你的实验数据。更扎心的是，你用了清除试剂，传了几代，检测还是阳性。本文覆盖支原体隐性感染的识别、清除失败原因、分模块排查方案和进阶疑难情况，帮你从试剂、操作、检测三个维度彻底解决。
第一步：快速排查低级错误
新手最容易在支原体清除上栽跟头，先对照以下几个基础错误：
- 用了过期的清除试剂：支原体清除剂（如M-Plasmocin）保质期通常只有6-12个月，4℃保存失效更快。检查瓶身日期，超过有效期直接换新。
- 浓度加错：处理浓度常用25 μg/mL（预防）或50 μg/mL（清除），但有人把μg/mL看成mg/mL，浓度差20倍，细胞直接中毒。用移液器前先算一遍终体积。
- 处理时间不足：支原体清除剂要求至少处理14天，期间每2天换液并补加药物。有人只处理3-5天就停药，残留支原体迅速卷土重来。
- 检测时间点不对：刚停药就做PCR，残留DNA片段可能假阳性；或停药后只测一次阴性就以为干净，实际上需要连续三代检测才能确认。
第二步：分维度系统排查
如果低级错误都排除了，但支原体依旧“春风吹又生”，请按以下实验流程模块逐项排查。
模块一：培养基与血清——支原体的“万能培养基”
现象：清除处理期间细胞状态还行，停药后2-3代PCR又阳性，且污染株多为猪鼻支原体或精氨酸支原体。
原理说明：支原体不依赖细胞本身存活，它直接消耗培养基中的精氨酸、核苷酸和脂质。如果培养基或血清本身被支原体污染，你的清除工作等于一边杀菌一边投毒——支原体在血清里繁殖，再随每次换液重新进入细胞体系。
解决步骤：
1. 更换新鲜批次的胎牛血清（FBS），建议选择经过三重0.1 μm滤膜过滤的产品，并索要支原体检测报告。
2. 培养基配制时，额外添加0.22 μm过滤步骤（即使粉末培养基说明书没要求），并每100 mL培养基加入1 mL青霉素-链霉素-两性霉素B混合液（终浓度100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、0.25 μg/mL两性霉素B）。
3. 弃用任何已经开封超过4周的培养基或添加剂，支原体在4℃仍可缓慢增殖。
验证方法：将新配培养基单独放入培养箱37℃孵育72小时，取200 μL上清做支原体qPCR；同时用新鲜血清直接接种支原体肉汤培养基（如Mycoplasma Broth），48小时后观察是否变黄。
模块二：细胞冻存库——隐藏的“定时炸弹”
现象：清除成功后，你从液氮复苏了一株老细胞，结果PCR阳性，之前的工作全部白费。
原理说明：支原体在-196℃液氮中可存活数年。如果早期冻存的细胞已隐性感染，而你继续使用这些种子库来扩增或保种，污染会跨代传播。关键是许多人只处理“在养”细胞，却忽略了冻存管中的污染株。
解决步骤：
1. 对所有液氮罐中的细胞株重新做支原体检测（推荐qPCR法，取冻存管中100 μL细胞悬液，离心取沉淀，提取DNA后扩增16S rRNA基因片段）。
2. 对阳性细胞株彻底清除后，重新建立主细胞库和工作细胞库。建议使用无抗生素培养基传代3次，确认无污染后再冻存。
3. 冻存液加10% DMSO时，同步加入支原体清除剂（浓度同日常维持量），冻存管标注“已清除+检测日期”。
验证方法：新冻存库每管细胞复苏后连续检测三代，每代取培养上清及细胞裂解液分别做PCR，只有三代全阴性才可入种子库。
模块三：清除剂使用方案——浓度、时间与细胞毒性博弈
现象：使用清除剂后细胞大量脱落死亡，或者根本没反应，PCR始终强阳性。
原理说明：支原体清除剂的作用机制通常是干扰支原体蛋白合成或DNA复制，但不同细胞株对清除剂耐受性差异很大。比如M-Plasmocin处理浓度为50 μg/mL时，对RAW264.7巨噬细胞毒性较高（48小时存活率仅70%），而对HEK293T几乎无影响。反过来说，若浓度过低（<20 μg/mL）或处理时间不足7天，支原体仅被抑制未被杀死。
解决步骤：
1. 先做毒性预试：取目标细胞铺96孔板，每孔1×10^4细胞，加入0、12.5、25、50、75 μg/mL清除剂，培养72小时后用CCK-8检测，选择细胞存活率>80%的最高浓度作为处理浓度。
2. 以选定浓度处理14天，每48小时换液并重新加药。注意换液时用PBS洗两次，减少死细胞及支原体碎片堆积。
3. 维持剂量减半：清除结束后，再用1/2清除浓度继续维持7天，以消灭残留的细胞内支原体（有些支原体可内化到细胞膜内）。
4. 处理期间每天观察细胞形态：若脱落超过30%，立即降低浓度到半数致死浓度以下，并延长处理时间到21天。
验证方法：处理第7天、第14天、停药后第7天分别取样，用支原体特异性qPCR（引物靶向16S rRNA基因保守区，阳性阈值Ct<35）。同时做Hoechst DNA染色：支原体污染时细胞核外出现点状荧光，清除后应消失。
模块四：实验室交叉污染——通风橱、水浴锅、移液器
现象：所有操作都很规范，但多个不相关的细胞系同时出现同一种支原体株。
原理说明：支原体可通过气溶胶传播。离心机、生物安全柜的HEPA滤网长期不换，或水浴锅水中滋生支原体，每次放血清或培养基进入水浴锅时，支原体随气泡爆裂形成气溶胶，落进敞口的培养瓶。
解决步骤：
1. 水浴锅每周换水，加入适量支原体清除剂（终浓度按说明书，如卡那霉素50 μg/mL）或抑菌剂（如异噻唑啉酮类）。
2. 生物安全柜每月用支原体清除喷雾（如Mycoplasma-Off）全面擦拭台面、内壁、UV灯管；更换HEPA滤网前先做浮游菌检测。
3. 移液器定期（每季度）拆开活塞部分，用70%乙醇擦洗，并用支原体PCR检测洗脱液。
4. 培养瓶盖不要拧紧？错！建议改用透气盖，但瓶身必须放生物安全柜内，不要在水浴锅或离心机旁开盖。
验证方法：在生物安全柜内放置一个敞开的支原体肉汤平板（含酚红指示剂），静置4小时，然后封口培养7天，若液体变黄则柜内存在支原体污染。
第三步：进阶疑难问题
1. 支原体形成生物膜或内化到宿主细胞内部怎么办？
常规抗生素难以穿透宿主细胞膜。此时需联合使用两种不同机制的清除剂：如喹诺酮类（如环丙沙星10 μg/mL）+四环素类（如多西环素5 μg/mL），交替作用，每3天换一种，共循环3次。同时增加胰酶消化时间（0.25%胰酶-EDTA在37℃处理5分钟，比常规3分钟更长），使支原体从细胞表面脱落，再换液清除。
2. 检测结果“阴阴阳阳”不稳定，是qPCR问题还是低载量支原体？
取同一样品做三种检测平行比对：qPCR（灵敏度高但假阳性风险）、Mycoplasma PCR ELISA（特异性强）、培养法（灵敏度低但最可靠）。如果qPCR Ct值在35-38之间波动，可能是取样量不足或DNA提取效率低。建议每份样品取2 mL培养上清，12,000 rpm离心20分钟，弃上清后再用200 μL PBS重悬沉淀提取DNA。另外，引物建议同时靶向16S rRNA和16S-23S rRNA间隔区，避免漏检。
3. 用商品化清除剂后细胞自发永生化了？
部分清除剂（如某些氟喹诺酮类）在高浓度下会诱导宿主细胞DNA损伤，加速染色体异常。处理完成后务必做核型分析（至少观察20个中期分裂相）和ICL（原位杂交）检查基因组整合情况，异常则弃用该细胞系，重新复苏早期冻存细胞。
避坑总结 + 实操建议
1. 核心结论一：支原体清除成功 = 换掉所有可能污染的“源”（血清+培养基+冻存库）+ 合理浓度/时间处理 + 连续三代检测验证，三者缺一不可。
2. 核心结论二：不要迷信单一清除剂，先做细胞毒性预试，联合用药或循环用药要胜过单药长时间处理。
3. 核心结论三：污染清除后，必须建立“无抗生素+定期检测”的常态机制，否则复发率超过50%。
4. 日常好习惯一：每两周对培养中的细胞做一次支原体qPCR，样品编好批次，固定用同一台提取仪和同一批次Master Mix，避免操作差异。
5. 日常好习惯二：液氮罐分区管理，新入库细胞必须隔离存放至少3周，检测确认阴性后才能移至主罐区。
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