来源：DNA Lab Space 实验教程 | 编译：DNA Lab Space
辛辛苦苦跑完无细胞表达，离心后却看到一管怎么都溶不开的沉淀——加缓冲液、超声、过夜搅拌，依然浑浊甚至直接析出。别急着扔样品，问题多半出在复溶策略上。这篇教程会从最容易被忽视的手误开始，带你按流程排查收集、洗涤、缓冲液、温度、去垢剂和复性步骤，再聊两个进阶疑难病例，帮你把沉淀“救”回来，并附上日常记录习惯和工具辅助思路。
第一步：快速排查低级错误
无细胞表达体系成分复杂，沉淀里不只有目标蛋白，还有裂解物碎片、核酸和脂质。新手最容易栽在以下4个基础错误上，先对照检查，能省下大量时间。
1. 离心后分错了管：把上清和沉淀搞混，或者倒上清时把沉淀带走了。 解决：离心后先在管壁上标记沉淀侧，用移液器吸上清，保留原管中沉淀，再用100μL缓冲液轻洗管壁确认。
2. 用纯水或PBS直接重悬沉淀。 解决：纯水离子强度太低，PBS不一定匹配蛋白等电点；换成含150～300mM NaCl、50mM Tris-HCl（pH 8.0）的缓冲液起步。
3. 沉淀不清洗直接加溶解液。 解决：先用含0.5% Triton X-100、300mM NaCl的洗涤液重悬沉淀，20,000g 4°C离心20分钟，弃上清，重复两次再进入复溶。
4. 涡旋振荡或超声处理过猛：不是把沉淀分散，而是让蛋白聚集更牢固。 解决：用移液器头轻柔吹打或用旋转摇床（10rpm），冰上操作，避免气泡。
第二步：分维度系统排查
排除低级错误后，沉淀还是复溶不理想？按下面5个模块逐步排查，每步都有现象、原理、解决和验证方法，建议从第1个模块走到第5个模块，不要跳步。
1. 收集沉淀：离心转速和时间够不够？
- 现象：离心后沉淀量看起来很少，但上清仍浑浊；或者复溶后总蛋白量低于预期。
- 原理：无细胞体系中的核糖体和膜碎片密度不均，普通10,000g离心15分钟可能只沉降大颗粒，而小聚集体还悬浮着。沉淀不全是目标蛋白，上清的浑浊可能是未沉淀的聚集体。
- 解决：改用20,000～25,000g，4°C离心30分钟。如果样品量大，使用固定角转子比水平转子更容易形成紧实沉淀。离心后在冰上静置2分钟再小心弃上清。
- 验证：取离心的上清和沉淀分别跑SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，看目标条带分布。如果上清仍有大量目标蛋白，说明离心条件需要加强。
2. 洗涤沉淀：有没有洗掉“粘稠杂质”？
- 现象：沉淀像“鼻涕”一样黏糊糊，用移液器吸不动，甚至拉丝。
- 原理：无细胞表达体系中释放的基因组DNA和高分子量RNA会与目标蛋白共沉淀，形成高黏度胶状物。核酸还会通过静电作用“绑住”蛋白，让复溶变得困难。
- 解决：在洗涤液中加入MgCl₂至2mM，再加入Benzonase核酸酶（25U/mL）或DNase I（10μg/mL），用移液器吹打均匀后37°C孵育20分钟。随后加入EDTA至5mM螯合Mg²⁺，再用20,000g离心20分钟。洗涤液配方：50mM Tris-HCl（pH 8.0）、300mM NaCl、0.5% Triton X-100、1mM DTT。
- 验证：观察重悬液是否从“黏稠”变成“顺滑”；取洗涤前后样品测A260/A280比值，若比值从1.5左右降到0.6以下，说明核酸去除效果良好。
3. 复溶缓冲液：pH、盐、去垢剂选对了吗？
- 现象：加缓冲液后立刻出现白色浑浊，或始终有细颗粒；同一缓冲液在不同批次沉淀上表现不一致。
- 原理：蛋白质在等电点附近溶解度最低。无细胞表达产物常带较多疏水表面，盐浓度太低无法屏蔽电荷，太高又可能“盐析”；非离子去垢剂能帮助分散疏水蛋白，但浓度和类型需要选择。
- 解决：使用“三件套”策略试出最佳条件：
1. 固定盐浓度150mM NaCl，设置pH梯度：7.0、7.5、8.0、8.5（50mM Tris-HCl）。
2. 固定最优pH，设置盐梯度：0、100、300、500mM NaCl。
3. 在最优pH和盐基础上，添加1%甘油、0.5% Sarkosyl（月桂酰肌氨酸钠）或0.1% Triton X-100作为去垢剂。若用Sarkosyl，复溶后需透析或加入5mM DTT辅助去除。
- 验证：每个条件下取100μL复溶液，20,000g离心15分钟，分开上清和沉淀，用BCA法测定蛋白量。以上清蛋白量/总蛋白量作为可溶率，记录每个条件的数值，选择最高的一组。
4. 复溶条件：温度、时间和搅拌方式控制了吗？
- 现象：冰