来源：DNA Lab Space 实验教程 | 编译：DNA Lab Space
无细胞蛋白合成（CFPS）是个好技术，但也是最容易让人“血压飙升”的实验之一——同一管提取物，昨天做出来产量2.1 mg/mL，今天变成0.3 mg/mL，换个批次又变成1.8 mg/mL。你以为是自己“手气差”，其实重复性差的背后，80%都是可排查、可修正的硬件问题。本文覆盖从试剂配制到反应孵育全流程，手把手帮你定位变异源头，让数据回归正常。
第一步：快速排查低级错误
新手最常在这几个地方翻车，先对照检查，能省掉后面一大半麻烦：
1. 模板DNA忘了定量——很多CFPS体系对DNA浓度极其敏感，比如PURE系统最适模板量可能是5-20 nM，你“按体积加”而不是“按浓度加”，批次间差异直接翻倍。解决：每次实验前用Qubit或qPCR精确定量，统一终浓度（例如10 nM）。
2. ATP/PEP没分装好——能源组分反复冻融，或者配好的PEP在4℃放了一周，磷酸烯醇式丙酮酸早就水解了。解决：所有能源组分按单次用量分装，-80℃保存，用完即弃，不要“顺便回冻”。
3. 镁离子浓度没换算——不同批次提取物（如E. coli S30、CHO lysate）最适Mg²⁺浓度差很大，S30可能12 mM最佳，CHO重组系统可能要16 mM。你沿用上次的体系，产量掉一半很正常。解决：每个新批次提取物先做Mg²⁺梯度（8、10、12、14、16 mM）小试。
4. 反应管没预冷——CFPS的起始时间很关键，室温下放5分钟，部分酶解反应已经在跑，导致不同样品“起跑线”不同。解决：所有反应管提前冰上预冷，最后统一放入孵育器。
第二步：分维度系统排查
如果低级错误都排除了，重复性依然差，那就按下面流程模块逐一过筛。每一步都给出现象、原理、解决和验证方法，建议从第1条开始顺序执行，不要跳。
1. 模板与加样环节
现象描述：相同批次提取物，只换了一次DNA抽提试剂盒，产量从2.0 mg/mL降到0.8 mg/mL，且三个平行复孔偏差 >30%。
原理说明：CFPS系统里，T7 RNA聚合酶对质粒DNA的超螺旋结构、模板纯度、内毒素水平都很敏感。残留的乙醇、盐离子或苯酚会直接抑制转录反应。更隐蔽的是质粒本身——如果同样的基因用了不同载体骨架，或者同一载体但质粒制备批次不同，其超螺旋比例不同，转录效率差异可达数倍。
解决步骤：
1. 统一使用同一批次、同一工艺制备的质粒，用琼脂糖凝胶确认超螺旋比例（主带 >80%）。
2. DNA最终浓度用稀释缓冲液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0）稀释至1 µg/µL左右，避免反复冻融——DNA浓度在0.1-1 µg/µL时冻融损伤最严重。
3. 如果必须换试剂盒，先做小规模对比实验：同一DNA模板，用旧试剂盒提取的质粒和新试剂盒提取的质粒分别跑CFPS，产量差异不超过15%才可替换。
验证方法：取新旧两种质粒各1 µL，测A260/280（应为1.8-2.0），并用1%琼脂糖电泳检查降解情况。同时在相同反应条件下，每种模板做3个平行孔，计算CV值（应 <10%）。
2. 提取物批次与储存
现象描述：同一实验方案，上一个月的提取物产量2.5 mg/mL，这个月新提的S30只有1.2 mg/mL，冻存超过3周的提取物也开始“掉链子”。
原理说明：细胞提取物是活体酶混合物，其质量高度依赖细胞生长状态、破碎方式和裂解液组分。OD600没到对数中期就收菌，核糖体数量不足；破碎压力不恒定，释放的核糖体比例不稳定。此外，提取物中残留的核酸酶和蛋白酶随储存时间缓慢降解关键组分，尤其是PURE系统，一管用多次，每次冻融都在损失活性。
解决步骤：
1. 标准化菌株培养：E. coli BL21(DE3) 在2×YT培养基中37℃培养，OD600达到0.5-0.6时迅速冰浴冷却，30分钟内完成离心和裂解。
2. 使用高压破碎仪时，压力统一为20,000-25,000 psi，并确保每次破碎循环次数相同（例如3次，每次4分钟）。
3. 提取物分装成50 µL/管，液氮速冻后-80℃保存。每管只允许冻融一次，用后即弃。在管壁上标注批次号和冻存日期。
4. 若发现同批次提取物间产量波动大，可在反应前加入RNase抑制剂（终浓度0.5 U/µL）和蛋白酶抑制剂（如Complete EDTA-free，1片/10 mL提取物）以增加稳定性。
验证方法：取新旧提取物各2个浓度（如10 µL和20 µL），加同样模板，跑CFPS。计算每批次内部CV和批次间CV。如果提取物本身均匀性差（批内CV>15%），可能是裂解或分装过程中产生了沉淀，需要重新离心去除不溶物。
3. 能源系统与辅因子
现象描述：反应产物产量低且不稳定，尤其是改用新买的PEP或ATP后，产量骤降；或者反应最初30分钟pH变化大，导致多个样品差异明显。
原理说明：CFPS依赖能源再生系统，常用PEP/pyruvate kinase或creatine phosphate/creatine kinase。PEP是强酸弱碱盐，溶解后pH会大幅下降，如果配溶液时没调pH或缓冲能力不足，反应体系pH会从7.5漂移到6.8，而核糖体和聚合酶在此pH下活性下降30%以上。另外，Mg²⁺与ATP、PEP的络合平衡会影响游离镁浓度，加样顺序不当（比如先加Mg²⁺后加ATP）会造成局部沉淀。
解决步骤：
1. 配制10×能源混合液时，将PEP溶于200 mM HEPES（pH 7.6）中，而不是纯水。每配制一批用pH计校验，确保pH在7.5-7.7。
2. 加样顺序固定为：水→缓冲液→Mg²⁺→NTP/能源混合液→模板→提取物，每加一种成分轻弹混匀，不要涡旋。
3. 镁离子浓度以提取物实际批次为准，建议先做梯度：在10-16 mM范围内以2 mM间隔测试，找到平台区的中值，并确保该区间内产量随Mg²⁺变化斜率平缓（即不是在悬崖边上）。
4. 反应体系中加入25 mM的磷酸肌酸（如果使用PC/CPK系统）时，注意其钠盐形式也会贡献钠离子，过高钠浓度（>80 mM）会抑制转录。
验证方法：设立“无模板”阴性对照和“已知产量”阳性对照（如标准化荧光蛋白模板，预期产量在0.5-2.0 mg/mL）。每次实验都跑这两个对照，如果阳性对照产量正常而你的样品低，问题大概率在模板；如果阳性对照都飘，问题在能源系统或提取物。同时检测反应前后pH，变化应<0.2。
4. 反应条件一致性
现象描述：两个相邻孔位，一个产量1.8 mg/mL，一个1.1 mg/mL；或者同一台PCR仪中间和角落的孔产量差异大。
原理说明：CFPS反应通常30°C孵育2-3小时，但孵育器的温度均匀性、升温速度以及盖子温度都会影响结果。PCR仪模块边缘与中心温度差可高达2-3℃；如果封膜不严，则是轻微蒸发，导致各孔渗透压和溶质浓度不同。
解决步骤：
1. 优先使用金属浴或带热盖的PCR仪，并且只使用中间区域（比如8联管只用中间6孔，外周加同样体积的水或空白管）。
2. 反应体系总体积保持一致（例如25 µL），如需要多个平行样，尽量使用同一块反应板，避免分布在两块不同板上。
3. 孵育前先在冰上组装完成，然后同时放入30℃金属浴，并记录时间。不要分批放入，否则会引入时间差。
4. 封板膜使用高粘性铝箔膜，并在四角压实，防止边缘蒸发。
验证方法：同一反应体系做8个复孔分布在板的不同位置（角落+中心），孵育后检测信号。如果CV>15%，说明温度均一性差或蒸发严重。可以改用20 µL体系并在反应板上覆盖矿物油（20 µL/孔）来消除蒸发影响。
第三步：进阶疑难问题
如果上述各环节都验证正常，但重复性依然玄学，考虑以下特殊情况。
1. 模板DNA中残留的RNA或翻译后修饰阻遏了组分
有时质粒提取过程中RNA未完全去除，残留的rRNA会非特异性地竞争核糖体结合位点，导致不同批次DNA的“有效模板量”偏差大。表现是：模板浓度越高，产量反而越低。解决：用RNase A（终浓度50 µg/mL，37°C 30 min）处理质粒后再纯化，并跑胶确认RNA条带消失。
2. 天然提取物中的批次内时空差异
即使同一管提取物，因为分装时沉淀不均，上层液体与下层液体的核糖体/酶浓度可能不同。解决方案：分装前必须轻轻颠倒混匀至少10次（不要涡旋），分装时用剪去尖端的100 µL枪头缓慢吸取。另外，从-80℃取出后，在冰上缓慢解冻30分钟，而不是室温快速解冻，避免蛋白质重分布。
3. 跨实验室/跨平台转移的“隐变量”
如果你把反应体系从E. coli提取物换到小麦胚芽或CHO提取物，除了Mg²⁺，还要考虑K➕和NH4⁺浓度。小麦胚芽系统对K⁺浓度很敏感，最适范围为80-140 mM；CHO系统需要额外的氧化还原稳定剂（如谷胱甘肽，终浓度1-2 mM）。换系统时，不要只照抄原配方，先做一个KOAc梯度（60、80、100、120、140 mM）和Mg(OAc)₂梯度。
避坑总结+实操建议
三条核心结论：
1. 模板和提取物是变异最大来源——每次实验必须加阳性对照，没有对照的结果不可信。
2. 能量系统是“沉默杀手”——PEP/ATP的pH、分装、储存细节决定反应底线，别在能源上省钱省事。
3. 温度和时间一致性是重复性的最后防线——板内差异80%来自加热不均和蒸发。
两条日常好习惯：
- 建立一个“批次日志”表格，记录提取物批次、冻存日期、模板浓度、Mg²⁺浓度、PEP批次、反应板位置、孵育器编号、产量。连续记录两周，你会发现规律比你想的多。
- 每次实验前用“盲测阳性对照”校准整个流程：如果阳性对照的产量在历史均值±20%以内，再开始实验；否则先修系统。
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