来源：蛋白纯化宿主蛋白共洗脱去除（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
纯化蛋白最崩溃的瞬间是什么？你按标准流程跑完Ni柱，SDS-PAGE一烤胶，目的蛋白是很亮，但旁边那几条杂带也阴魂不散——宿主蛋白共洗脱了。更麻烦的是，你试着提高咪唑浓度去洗杂，结果目的蛋白产量掉了一半。别急，这篇文章直接带你从最基础的排查开始，一步步走到进阶问题，把这堆烦人的杂带处理干净。
第一步：先别怀疑层析柱，检查这三个地方
在调整纯化方案之前，先花五分钟确认下面几件事，很多人的问题根本不是纯化策略有误，而是前处理就埋了雷。
1. 裂解液里加核酸酶了吗？ 核酸没被降解，会让裂解液像鼻涕一样粘稠，粘度大导致柱子流速异常，大量蛋白被非特异截留，全混在一起。裂解后加入终浓度1 μg/mL的DNase I（或Benzonase），冰上放置15分钟，等液体明显变稀再上柱。
2. 平衡和洗杂的缓冲液pH准确吗？ 缓冲液pH偏了0.5个单位，某些宿主蛋白的带电状态就变了，和介质的结合力急剧增强。上柱前用校准过的pH计重新测量，4°C下pH值会漂移，务必在实验温度下校准。
3. 你的样品离心或过滤彻底了吗？ 裂解液里残留的细胞碎片会直接堵柱，把层析介质表面的结合位点掩盖掉，导致分辨率骤降。上柱前12000 × g，4°C离心30分钟，再用0.22 μm滤膜过滤，这一步不要省。
排除掉这些问题后，就算还有共洗脱，至少你不会在错误的方向上浪费半天时间。
第二步：分维度系统排查，锁定共洗脱的根源
如果低级错误都排除了，杂带还是很顽固，那就按下面这个流程一步步排查。
模块一：样品前处理——共洗脱的根源在第一步
现象描述：上样前样品就浑浊，或者离心后的上清表面漂浮着一层脂质。纯化后杂带多且杂，背景很高。
原理说明：宿主蛋白分为可溶性和不溶性两大类。大肠杆菌裂解后，许多分子伴侣、外膜蛋白和核糖体相关蛋白依然与目的蛋白互作或形成聚集体。若裂解不充分或裂解液成分不当，这些蛋白会被一起结合到介质上。另外，脂质和多聚核酸会作为"桥"连接目的蛋白和宿主蛋白，形成共聚集体。
解决步骤：
1. 在裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，pH 8.0）中加入1% Triton X-100和1 mM DTT，注意如果后续用Ni柱，DTT浓度可适当降低以免影响镍离子。
2. 裂解后做一步额外的澄清处理：先用低转速6000 × g离心15分钟去除未裂解细胞，再取上清，补充MgCl₂至终浓度5 mM，加Benzonase至终浓度25 U/mL，室温放置20分钟，最后12000 × g离心30分钟。
3. 上样前取样跑一管胶，标记为"Load"，冷藏保存，方便后续对比。
验证方法：取等量裂解前后的样品跑SDS-PAGE，看是否有个别条带在裂解上清中大量富集。如果这些杂带在上样前就已经在裂解液里大量存在了，那问题出在源头；如果上样前样品看起来只有少数几条带，问题则出在后续的洗杂环节。
模块二：结合与洗杂环节——重心放在这里
现象描述：目标蛋白洗脱下来后，伴随2-3条明显杂带，分子量可能在25 kDa附近或75 kDa以上，且重复纯化不同批次都会出现相同分子量的杂带。
原理说明：Ni柱纯化时，宿主蛋白中的天然组氨酸簇或金属结合蛋白会与Ni²⁺发生非特异性吸附，这是最常见的共洗脱原因。洗杂液中咪唑浓度如果定在10-20 mM，这些弱结合杂蛋白无法被有效除去，最终在洗脱峰中出现。
另一种情况是：洗杂体积不足，样品体积大、柱子载量高，洗涤液没有足够体积把竞争性杂蛋白替换出来。很多操作者只洗了5个柱体积，但实际实验要求增加到10-15个柱体积，甚至分两次洗涤。
解决步骤：
1. 先将洗杂缓冲液的咪唑浓度从10 mM提升到30-40 mM，用一套低浓度梯度的咪唑测试一下杂蛋白的洗脱行为。取少量介质分批做小离心柱实验（batch binding实验），用20 mM、50 mM、80 mM的咪唑逐步测试哪些杂蛋白能被优先洗下。
2. 如果样品体积大（超过柱子体积的10倍），延长上样时间，洗杂10-15个柱体积，分两阶段进行：先低咪唑（30 mM）5-10 CV，再中咪唑（60 mM）5 CV。洗杂流速控制在1 mL/min（约柱体积的1/5），流速太快洗不干净，太慢又容易非特异吸附。
3. 若仍然有杂带，换用不同化学性质的洗杂剂：添加0.5% CHAPS或0.1% Tween-20到洗杂缓冲液中，有助于去除非特异性疏水作用结合的杂蛋白。
验证方法：将洗杂流出液分级收集，每收集到1 mL换一个离心管，跑胶看哪种杂蛋白在哪个阶段被洗掉。如果杂蛋白在低咪唑阶段已大量流出，说明提高洗杂液咪唑浓度有效；如果杂蛋白直到洗脱阶段才和目的蛋白一起释放，那就不只是离子交换层面的问题了，很可能是疏水作用力导致的共洗脱。
模块三：洗脱条件分辨率的精细化——最后的缓冲液调整
现象描述：一个大的洗脱峰中包含目的蛋白和杂蛋白，峰形不左右不对称，或者出现肩峰。
原理说明：洗脱时如果直接用300-500 mM咪唑一步洗脱，分辨率低，和杂蛋白紧密结合的蛋白也会被一起冲下来。梯度洗脱给了弱结合杂蛋白先脱落、目的蛋白后脱落的机会。如果柱效不够或洗脱流速过快，梯度会被展宽，造成分辨率下降。
解决步骤：
1. 把一步洗脱改成线性梯度洗脱：以Ni柱为例，从50 mM咪唑在20分钟内匀速升高至300 mM咪唑（比如GE的AKTA系统，流速1 mL/min，收集1 mL/管）。在目标峰前后各取几管跑胶。
2. 降低洗脱流速到0.5-0.8 mL/min，延长洗脱时间至30分钟，让蛋白与介质充分竞争解离。
3. 洗脱缓冲液中添加10%甘油，减少蛋白间非特异性聚集，有的杂蛋白是通过与目的蛋白形成二聚体被共洗脱的。
验证方法：梯度洗脱后重点分析峰尖之前的洗脱管——如果杂蛋白主要集中在峰前沿，说明你要么降低洗脱起始浓度，要么延长梯度时间；如果杂蛋白均匀分布在峰的各管，那问题又要重新回到"蛋白间互作"的角度考虑，可能需要加入ATP（帮助去除分子伴侣）或在更高盐浓度下进行后续的凝胶过滤层析。
第三步：进阶疑难问题——碰到这些情况，可能需要换个思路
排查到了这一步，还有三个进阶情况，属于不常见的共洗脱，容易被忽视。
进阶问题一：目的蛋白与宿主蛋白形成稳定复合物。 这类情况多见于真核蛋白在原核系统中表达时，部分错误折叠或部分正确折叠的蛋白会与触发因子（Trigger factor）或DnaK/DnaJ分子伴侣结合。常规的咪唑浓度即使冲到500 mM也无法将它们分开。这种情况下的特征是：杂带分子量比目的蛋白大得多，并且在凝胶过滤层析（SEC）中与目的蛋白一起出峰。解决方法：在裂解缓冲液中添加2-5 mM ATP和5 mM MgCl₂，低温孵育半小时后再上柱，促使分子伴侣释放。如果这一步无效，就需要考虑在下游增加一步离子交换或SEC了。
进阶问题二：被共洗脱的是宿主的核酸结合蛋白，比如HU蛋白或Fis蛋白。 如果目的蛋白本身带正电荷（pI高），容易被核酸包裹，核酸又拉来核酸结合蛋白。这类杂蛋白通常在UV 260读值明显高于280时被注意到。解决方法：在裂解后上柱前，进行多聚磷酸盐沉淀或在裂解缓冲液中加入0.5 M精氨酸——精氨酸能竞争结合核酸和蛋白的界面，且不影响His标签结合。
进阶问题三：去污剂让杂蛋白从膜上释放溶入上清，吸附到疏水区域。 如果你用的是大肠杆菌做膜蛋白表达，换用温和去污剂正面临一个两难：去污剂浓度低，膜蛋白不溶；浓度高，膜杂蛋白溶出量增大。这种情况下共洗脱的杂带往往分子量很集中，且批次间差异不大。解决方法：如果条件允许，尝试用两相萃取把膜蛋白粗分离后再上柱，或者在裂解缓冲液中固定0.5%的肌氨酰（N-lauroylsarcosine），维持膜蛋白可溶的同时降低膜碎片本身的干扰。
避坑总结与实操建议
三条核心结论：
1. 共洗脱的杂蛋白90%在洗杂环节就能解决——洗杂缓冲液不要省咪唑体积，30-40 mM咪唑洗10-15个柱体积是常规操作。
2. 梯度洗脱永远比一步洗脱更可靠。花20分钟做线性梯度，能帮你精准切掉杂带，保留高纯度目的蛋白。
3. 裂解上清如果本身就不清亮，后面所有纯化工作都是在做无用功。前处理多加5分钟，纯化省心两小时。
两条日常的好习惯：
- 每次做纯化，保留每一个步骤的样品（裂解液、上样流出液、洗杂液、各洗脱管），全部跑一次胶，养成习惯。 有了完整的样品记录，故障排查就是看胶回顾的过程，不需要盲猜。
- 每次实验前，花两分钟计算清楚：你的柱子载量是多少？样品体积和总蛋白量是否匹配？ Ni柱一般载量在5-40 mg蛋白/mL介质，如果你2 mL介质就要上100 mg总蛋白，那超载带来的穿透和共洗脱会让你排查到头秃。
当你解决了共洗脱，把目的蛋白提纯后，如果发现表达量本身就不高，或者蛋白呈包涵体状态，那不妨回头看看你的表达构建是否合理——检查一下密码子优化是否适应你的宿主系统，一个优秀的表达载体设计，能帮你从源头省去大量纯化烦恼。分子克隆技术的细节优化，往往决定了蛋白纯化时你究竟是轻松跑完流程，还是和杂蛋白苦战到底。