来源：核酸提取宏基因组宿主DNA去除（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做宏基因组测序，最怕什么？不是提取的核酸量不够，而是满怀期待上机，结果80%的reads都来自宿主。宿主DNA残留，直接把你目标微生物的信号稀释成背景噪音。你反复优化，试了各种试剂盒，问题还是老样子。别急着怀疑试剂盒，更别直接怪样本。这篇文章只讲一件事：宿主DNA去除失败，到底卡在哪一步？从低级错误到进阶坑，带你按流程过一遍。
第一步：快速排查低级错误
新手最容易在三个小地方翻车，先对照检查一遍。
1. 样本裂解过度。 如果用的是基于差异裂解（differential lysis）的方法，目的只裂解宿主细胞，你却用了本该裂解微生物的强力破壁程序。结果宿主和微生物一起裂解，后续去除步骤直接失效。解决：严格区分宿主裂解液和微生物裂解液，先温和裂解（如使用0.1% Triton X-100或试剂盒自带的Host Lysis Buffer），离心收集微生物沉淀，再走微生物裂解。
2. 宿主去除步骤的缓冲液配错或失效。 比如用了已经过期的DNase或蛋白酶K。酶活性下降，再多的孵育时间也白搭。检查Buffer有无沉淀，酶是否分装保存。别心疼，重配。
3. 离心条件不对。 去除宿主DNA的试剂盒中，很多用离心柱或磁珠区分宿主与微生物。离心力太小，宿主DNA-磁珠复合物没沉下来；离心力太大，微生物沉淀被震起来。参照说明书，通常离心>10,000 g保持3-5分钟，具体以你的试剂盒为准，用离心机校准。
4. 样本起始量太少。 微生物载量低时，宿主DNA占比非常高，去宿主过程会导致微生物核酸同步损耗，最后测序数据量不足，看起来像“宿主污染严重”。加大样本量（如粪便样本从200 mg加到500 mg），或进行平行提取后合并。
以上四个都排除了？往下走。
第二步：分维度系统排查
按实验流程分模块，逐一拆解。每个问题，我都给出现象、原理、动作链。
模块1：样本前处理与宿主细胞裂解（问题出在源头）
现象：提取的总DNA中宿主占比>50%，且酶解去除后依然高。
原理说明：宿主DNA去除的核心逻辑是“先裂解宿主细胞，再通过酶或沉淀法去掉释放的宿主DNA”。如果宿主细胞没有充分裂解，完整的细胞会带着基因组进入后续步骤，导致任何DNase或沉淀策略都无法彻底去除（因为DNA被包在核膜里，酶接触不到）。
解决步骤（按顺序操作）：
1. 取新鲜或-80°C保存<3个月的样本。冻存时间过长，宿主细胞膜破裂，游离DNA大量增加，差异裂解失效。
2. 加入宿主裂解液前，先用涡旋振荡器高速混匀15秒。很多样本（如组织块）需要提前用研磨棒或剪刀物理剪碎到<2 mm³。
3. 宿主裂解液体积按说明书加足，例如200 mg样本对应1 mL裂解液。不要因为样本少就等比减少裂解液，否则浓度不足。
4. 孵育温度控制在37°C，时间是关键——不要超过说明书上限（常见5-10分钟）。温度过高或时间过长，微生物细胞也会被裂解。
验证方法：取出孵育后的悬液，滴加1 µL SYBR Green I染料，荧光显微镜下看。如果视野里只有碎片和少量完整杆菌/球菌，说明宿主已裂解。若看到大量完整细胞核形态，回到步骤2，延长37°C孵育至15分钟（前提是确认该步骤不影响后续微生物活性），或者增加裂解液体积。
模块2：宿主DNA的酶切或选择性沉淀
现象：QC合格，qPCR显示宿主基因（如人类β-actin或线粒体16S）Ct值<20，微生物通用16S Ct值正常，但上机后宿主参考基因组比对率依然高。
原理说明：这一步常见两类策略。一是DNase I消化：释放出的宿主线性DNA被降解，而微生物一般被沉淀保护，或微生物DNA未释放所以不被消化。二是选择性沉淀：用裂解液中的某种组分（如PEG/NaCl）优先沉淀微生物，上清则含有宿主DNA被弃去。失败原因往往在于消化条件不足或沉淀不完全。
解决步骤：
1. 检查DNase I反应体系：推荐用10 U/µL的DNase I，按每100 µL反应体系加5 µL。37°C孵育30分钟，不要少于20分钟。
2. 关键点——加入DNase I之前，务必确认反应缓冲液中的二价阳离子（Mg²⁺）浓度达标。如果稀释过度，酶活性急剧下降。一般需要MgCl₂终浓度5-10 mM。
3. 如果使用沉淀法，注意PEG的终浓度和温度。常见配方为10% PEG 8000 + 0.8 M NaCl，冰上放置15分钟后，以12,000 g、4°C离心10分钟。离心后看到管底白色沉淀，弃上清。若沉淀不明显，大概率是PEG浓度配低了。
4. 酶切后一定要立刻进行DNA纯化（如磁珠法或柱法），因为DNase I残留会继续降解后续微生物DNA，造成假低产量。纯化时加入3倍体积的PB缓冲液（若用Qiagen胶回收试剂盒）或按磁珠试剂盒操作。
验证方法：取纯化产物跑1%琼脂糖凝胶电泳。理想结果应该是：泳道顶部无明显大片段条带（>10 kb），而在1-3 kb处有模糊弥散条带，这通常是微生物DNA碎片或RNA。若顶部还有明亮大条带，说明宿主DNA降解不完全，回到孵育温度或延长至45分钟。若连弥散条带都没有，说明DNA全被降解了，回到模块1检查裂解时长是否过头。
模块3：微生物裂解与DNA回收
现象：宿主去除率>99%，但最终DNA总量＜1 µg，没法建库。
原理说明：前两步把宿主DNA清干净后，微生物细胞此时必须被有效裂解。如果这一步效率低，要么微生物壁厚难破坏（革兰氏阳性菌和真菌），要么你沿用了宿主裂解的条件，过于温和。
解决步骤：
1. 先要确认你用的微生物裂解缓冲液含有溶菌酶（终浓度20 mg/mL）和蛋白酶K（终浓度1 mg/mL），37°C孵育30分钟。
2. 物理破壁：使用珠磨仪（如MP FastPrep），设置6 m/s，40秒，运行2次，两次之间冰上冷却2分钟。若没有珠磨仪，可用液氮研磨替代。
3. 破壁后加入10% SDS至终浓度1%，65°C孵育10分钟，充分释放DNA。此时溶液应变得清亮粘稠。
4. 使用酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提一次，取上清后加0.1倍体积的3 M醋酸钠（pH 5.2）和2倍体积无水乙醇，-20°C沉淀1小时。沉淀后用70%乙醇洗涤一次，晾干，重悬于30 µL无核酸酶水中。
验证方法：利用Qubit dsDNA BR定量，如果浓度≥30 ng/µL，总量则≥900 ng，足够建库。同时可以跑胶看主带：如果条带偏大（>15 kb），说明DNA完整性好；如果分布均匀的弥散且<1 kb，说明降解严重，需要回溯到珠磨速度和次数。珠磨太快，DNA会被打成碎片。
第三步：进阶疑难问题
下面这些情况比较棘手，但遇到时别慌，按对应策略来。
1. 宿主DNA去除后，微生物多样性反而变低了？
原因：你过度使用温和裂解法去宿主导致部分脆弱的革兰氏阴性菌（如拟杆菌属）在第一步就破裂了，它们的DNA在后续被当成“宿主DNA”一起被弃掉。解决办法：调整宿主裂解时间。比如人粪便样本，37°C孵育时间从5分钟减少到3分钟，然后立即低速离心（200 g，1分钟）收集上清中完整的细菌。如果测序发现当时主要缺失的是厌氧菌，还可以将样本在厌氧工作站中操作，减少氧化应激造成的细菌裂解。
2. 某种宿主（如植物）的叶绿体/线粒体DNA干扰去除？
植物样本的宿主DNA包括核基因组DNA和大量的质体DNA，普通的裂解酶很难区分。进阶策略：在样本研磨后先低速离心去除植物纤维和细胞壁碎片，再用特定的质体DNA甲基化差异来分离。简单做法：在宿主裂解缓冲液中加入非离子型去垢剂（如0.05%的NP-40），并辅助一个蔗糖密度梯度离心（0.6 M蔗糖垫，5,000 g离心20分钟）。质体难以穿透蔗糖垫，保留在上层，而完整细菌会沉入垫底。但这一操作通量低，适合样本数少的疑难样品。
3. 去宿主过程中RNA污染导致后续cDNA合成紊乱？
很多宏基因组流程不建cDNA，但如果你做的是宏转录组或对RNA病毒有要求，宿主DNA去除时往往伴随着RNA降解。若你的定量结果显示DNA合格但RNA电泳显示降解，大概率是宿主裂解液中含有RNase。解决：宿主裂解液在使用前加入RNase抑制剂（如RNaseOUT，终浓度2 U/µL）。另外，酶切步骤中使用DNase I（不含RNase的级别）——很多便宜的DNase混有RNase，务必选超纯级。
避坑总结 + 实操建议
三句话记住核心：
1. 宿主裂解不彻底是万恶之源，去宿主失败时先回看这一步，别盲目增加DNase量。
2. 酶切和沉淀必须二选一做到位，不是走过场。孵育时间（30分钟）、温度（37°C）、二价阳离子（5 mM Mg²⁺）缺一不可。
3. 每一步之后都要设验证节点——跑胶、qPCR、Qubit定量，别憋到最后才看结果，那时样本已经没了。
两个日常好习惯：
- 每次提取都留一份“去宿主前样本”的aliquot（10 µL），放在-80°C。一旦结果异常，你可以回溯对比，判断问题出在去宿主前还是后。
- 详细记录每个样本的宿主裂解时间、离心转速、DNase批次。宿主动物或植物种类不同，最优条件差异极大；有记录才能建立你自己的优化曲线。
如果你正卡在引物或探针设计上，宿主DNA去除之后的微生物丰度检测也可能失真。推荐你试试站内的宏基因组引物设计工具，可以按16S区段或功能基因自动评估覆盖度。若遇到宿主序列干扰严重，也能使用密码子优化工具来合成对照基因。文本来自我们站内，但对你的帮助是实实在在的。任何关于宿主去除效果的定量验证，不要忘了用qPCR先测一下宿主基因的拷贝数：Ct＞28才算基本干净，否则请按上面的步骤再来一轮。