来源：DNA Lab Space 实验教程 | 编译：DNA Lab Space
# CRISPR敲除效率低？sgRNA设计问题N步排查一次说清
开篇导语
转染做了、抗生素筛了、单克隆也挑了，送去测序却全是野生型——这种“敲了个寂寞”的感觉，做过CRISPR的人应该都懂。敲除效率低的原因很多，但一半以上出在sgRNA设计上。本文按实验流程，从最基础的低级错误到进阶疑难，帮你一步步排查：如何设计、如何构建、如何验证、如何转染，每一步都给出具体参数和能落地的操作方案。
第一步：快速排查低级错误
新手敲不出来的原因，往往不是技术问题，而是这三个：
1. sgRNA序列里带了PAM：设计时把NGG也写进20bp的靶序列，导致识别失败。解决：序列只保留PAM前面的20个碱基，PAM不写入sgRNA。
2. U6启动子转录起始碱基不是G：U6要求第一个转录碱基是G，如果你的靶序列5'端是A或T，转录效率会骤降。解决：在sgRNA前面补一个或两个G（在载体引物里加），保证第一个碱基为G。
3. oligo引物没有加磷酸化修饰：克隆时退火后的双链DNA需要5'磷酸才能连入载体，如果合成时不要求5’磷酸化，连接效率极低。解决：合成oligo时勾选“5'磷酸化”，或退火后用T4 PNK处理。
第二步：分维度系统排查
排除了低级错误后，按以下模块逐一过。每个原因都按「现象→原理→解决→验证」的格式展开。
模块A：sgRNA设计规则
1. 靶点位置不合适
现象：转染后T7E1酶切检测，切割条带很弱或完全看不到。
原理：sgRNA切在CDS区域才能有效破坏蛋白。如果靶点落在内含子、UTR或极靠近起始密码子（30bp内），NHEJ修复后可能不影响转录和翻译。
解决：优先选择目标基因CDS的前1/3段，尤其第一个编码外显子内、ATG下游50-200bp的区域。避开最后一个外显子——它被切掉后可能只产生C端截短蛋白，仍保留部分功能。
验证：换2~3个不同位置的sgRNA，用同一种转染条件比较T7E1条带灰度。
2. GC含量过高或过低
现象：PCR能扩出目的条带，但T7E1酶切后没有任何多一条带。
原理：GC含量过高容易形成发夹结构，过低则导致靶序列与sgRNA结合不够稳定。我们的经验是40%~60%成功率最高。
解决：设计靶序列时用sgRNA设计工具，手工挑靶时尽量选GC含量在40%~60%之间、长度20bp、不要有连续4个以上单碱基重复。
验证：用RNA二级结构预测软件（如RNAfold）检查sgRNA自身折叠能ΔG，如果ΔG小于-10 kcal/mol，换靶点。
3. 靶序列中含有连续4个T
现象：转染后检测不到转录产物，但质粒测序正常。
原理：U6启动子驱动的sgRNA转录时，遇到连续4个T（TTTT）会被当作RNA聚合酶III的终止信号，导致转录提前终止。
解决：在设计时直接排除含有TTTT序列的靶点。已经选好了就重新设计，别纠结。
验证：提取细胞总RNA做RT-PCR检测sgRNA表达（设计一个跨sgRNA区域的引物），如果产物长度短于预期，说明转录终止。
模块B：载体构建问题
4. oligo退火后连接效率低
现象：转化后菌落很少，挑8个克隆，PCR鉴定阳性率不足30%。
原理：oligo退火形成的双链插入片段只有~22bp，如果不进行5'磷酸化，T4 DNA连接酶无法形成完整磷酸二酯键。
解决：退火前将oligo用T4 PNK处理：1μL oligo（10μM）+1μL 10×T4 PNK缓冲液+1μL ATP（10mM）+0.5μL T4 PNK，37℃孵育30min，65℃灭活10min。或者直接购买5'端磷酸化的oligo。
验证：做一个“无插入片段、只有线性化载体”的自连对照，如果自连对照菌落数与实验组差不多，说明载体去磷酸化不彻底或插入片段没连上。
5. 载体酶切不完全或自连背景高
现象：转化后长出的菌落全部是空载体，测序没有sgRNA序列。
原理：载体酶切后单酶切或酶切不彻底，导致线性化载体在连接酶作用下重新环化。也有可能是酶切后未切胶纯化，残留的酶或buffer干扰连接。
解决：BbsI或BsaI双酶切后，跑1%琼脂糖胶，切下线性化条带（通常比超螺旋慢），用胶回收试剂盒纯化。然后加1μL 快碱性磷酸酶（rSAP）处理30min，减少自连背景。
验证：取1μL 线性化载体直接转化感受态细胞，若菌落数>10，说明载体未被完全酶切或去磷酸化失败，需要重新处理。
模块C：细胞转染与筛选
6. 转染效率太低
现象：GFP对照荧光率<30%，T7E1检测条带极淡。
原理：Cas9和sgRNA必须进入足够多的细胞才能产生可检测的编辑信号。悬浮细胞、原代细胞用脂质体转染效率通常很低。
解决：改用核转染或电转。以NEPA21电转仪为例，HCT116细胞推荐：电击电压125V（？) 需查参数。以Lonza 2B为例，HCT116用程序DS-138。如果没有电转仪，就优化脂质体：24孔板每孔铺5×10^4细胞，0.5μg质粒+1.0μL Lipo3000，转染试剂与DNA比例按1~2（μL:μg）梯度优化。
验证：转染后24~48h，用流式或荧光显微镜检测GFP阳性率，必须≥70%才继续；如果低于50%，提高细胞密度或换转染试剂