来源：无细胞表达体系蛋白沉淀分子拥挤剂（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做无细胞表达，最怕的不是没蛋白，而是蛋白全在沉淀里。你换了分子拥挤剂，从PEG 3350换到Ficoll 400，甚至加了海藻糖，结果跑SDS-PAGE一看——上清干净得像水，沉淀里什么都有。这活儿不怪你手气差。
咱们一步步拆。
第一步：快速排查低级错误
别急着怀疑拥挤剂浓度不对，先看最基础的几个点：
1. 质粒模板浓度没归一化
你按体积加样，但不同批次质粒浓度差一倍，翻译负荷直接翻倍，核糖体忙不过来就团聚。定量到1 µg/50 µL反应体系，再用无核酸酶水补齐。
2. Mg²⁺没做梯度就直接上了
无细胞体系里Mg²⁺最佳窗口很窄，通常8–12 mM。少了核糖体不干活，多了蛋白直接非特异聚集。拿同一批提取物，先跑12 mM Mg(OAc)₂和10 mM两管对照，30°C、800 rpm孵育2小时再比较上清。
3. 反应管壁没预处理
PVDF或未硅化的EP管，疏水蛋白在管壁上吸附量远超你预期。换低吸附管，或者反应前用0.1% BSA/PBS润洗管壁再倒掉。拿PBS润洗后加5 µL 10% Tween 20到50 µL体系里，配好了直接上。
4. 温度用37°C跑全程
37°C是E. coli lysate的最适翻译温度，但也是蛋白酶最活跃的温度。蛋白翻译后还没叠好就被降解，碎片全堆进沉淀。改成30°C孵育，蛋白质聚集率通常下降30%以上。
搞清楚低级错误后还是沉？往下走。
第二步：分维度系统排查
顺着实验流程逐步排查，每个原因给出具体对策。
模块一：分子拥挤剂种类选错
现象描述： 加了分子拥挤剂（如PEG系列）后，反应液在孵育前30分钟就开始浑浊，但24小时后连沉淀都没有，离心也离不出来。另一种情况是孵育结束后溶液透明、底部出现白色沉淀，把沉淀溶解后SDS-PAGE显示目标蛋白条带极强。
原理说明： 分子拥挤剂不是随便加的。PEG作为一种惰性聚合物，通过排除体积效应提高蛋白质有效浓度，但分子量不同对蛋白行为的影响差异极大——PEG 4000排斥作用弱但渗透压高，PEG 8000以上则显著降低蛋白质溶解度和构象稳定性。文献里常推荐PEG 4000，但那是用于提高翻译产量的条件，对易聚集蛋白反而不适用。Ficoll 400分子量更大，体积排斥机制更为温和，天然蛋白折叠中间体在这种条件下反而更稳定。不同体系（如E. coli lysate vs. 小麦胚芽提取物）对拥挤剂兼容性完全不同，同样是10% PEG 4000，E. coli体系可能完全抑制翻译。
解决步骤： 做分子量梯度对比，PEG 3350、PEG 4000、Ficoll 400，按2%、5%、8%（w/v）终浓度各跑一管。每管体积做50 µL，加完模板0.5 µg后，先不加拥挤剂，30°C预孵育10分钟让翻译启动，再加入预配好的分子拥挤剂母液。这一步能减少高浓度拥挤剂对翻译起始的瞬时冲击。同时做一个不加拥挤剂的对照。
验证方法： 不离心直接取总样和上清样对比跑胶——如果无拥挤剂管中目标蛋白在上清中含量更高，说明问题在拥挤剂不在你的蛋白本身。把PEG换成Ficoll 400后重复。
现实里，10% PEG 4000导致沉淀的情况，换0.5 mM L-Arg + 5%海藻糖组合后，上清可溶蛋白从15%提升到78%。L-Arg能屏蔽蛋白表面疏水口袋，海藻糖则稳定水化层。
模块二：拥挤剂浓度和添加时机未优化
现象描述： 用5% PEG 4000获得很好结果，但同样体系直接把浓度加到8%，蛋白产量反而下降40%，沉淀明显增加。或刚开始反应就加入拥挤剂，翻译被完全抑制。
原理说明： 拥挤剂浓度对蛋白质折叠动力学是非线性关系。低浓度时，拥挤环境加速折叠进程使蛋白正确折叠；超过阈值后，排除体积效应增强的疏水相互作用占主导，蛋白质在部分折叠态直接互作，形成不可逆聚集体。具体阈值因蛋白而异，一般在5%–10%的范围内；但更关键的是添加时机——在翻译起始阶段加入拥挤剂会干扰70S核糖体组装和氨酰-tRNA入位，导致翻译效率急剧下降。
解决步骤： 采用浓度梯度和时间双重筛选。对每个拥挤剂做2%、4%、5%、6%、8%系列，各20 µL反应体系，模板量0.2 µg。先30°C静置5分钟——注意是静置不振荡——让翻译启动完成，再添加对应拥挤剂母液至目标浓度，继续30°C静置2小时。如果目的蛋白表达时间短（DNA别太长，30分钟表达），反应30分钟后补加0.5%–1%的PEG 4000，相当于折叠辅助后处理。
验证方法： 比较同一浓度在启动前后添加的差异：若启动后添加的组上清显著高于启动前添加组，说明拥挤剂对翻译起始有负面影响。直接取5 µL总反应液用4× Laemmli buffer溶解后跑胶，观察总蛋白量是否随拥挤剂浓度先上升后下降——产量拐点处往往是可溶蛋白的最优区。
模块三：蛋白本身的折叠属性与体系不匹配
现象描述： 不管你如何调整拥挤剂种类和浓度，目的蛋白始终以包涵体形式存在。沉淀可以用8 M尿素溶解，但复性后没有活性。
原理说明： 无细胞体系里缺乏伴侣蛋白网络的动态调控。体内条件下，DnaK/DnaJ/GrpE和GroEL/GroES系统在翻译过程中即与新生肽链结合，但在E. coli lysate中，这些内源伴侣浓度往往低于发挥有效折叠功能的阈值。分子拥挤剂虽然能稳定折叠态的蛋白，但它无法解决翻译过程中新生肽链过早暴露疏水表面所引发的共翻译聚集问题。对于含二硫键或结构域间连接肽较长的蛋白，糖基化和二硫键异构化在这一系统中均无法有效发生。
解决步骤： 把分子拥挤剂策略与折叠辅助策略叠加：
1. 在反应体系中直接补充0.2 mg/mL GroEL/ES或0.1 mg/mL DnaK/DnaJ/GrpE（商品化纯品），在加入模板前，与提取物冰上预孵育5分钟。
2. 加入终浓度2 mM的氧化型谷胱甘肽GSSG和4 mM还原型谷胱甘肽GSH，为二硫键形成提供氧化还原缓冲，二硫键异构酶DsbC也按0.05 mg/mL加入。
3. 对二硫键较多的蛋白，使用预折叠还原型无细胞体系，将半胱氨酸残基在表达前通过定点突变置换成丝氨酸或丙氨酸突变体，增加可溶性而不是活性。
4. 若上述手段仍不能奏效，改用PEG 4000为2%、Ficoll 400为3%的低拥挤组合来部分复现内质网环境。
验证方法： 表达产物分为三份：全细胞裂解液、离心后的上清液、以及8 M尿素溶解沉淀后的组分，分别跑SDS-PAGE。看可溶组分主要分布在上清还是尿素溶解组分，如果分布均匀则说明蛋白处于动态折叠中间体——可以在4°C透析去除尿素后，用氧化型GSSG复性，同时做活性检测。
模块四：能量体系和副产物抑制
现象描述： 反应前30分钟正常表达，之后突然停止，蛋白质合成量不再增加，同时伴有沉淀增加。实际上这时体系内pH已经偏向碱性，因为能量再生的副产物在积累。
原理说明： 无细胞体系中的磷酸盐缓冲能力和ATP再生系统是有极限的。磷酸肌酸/肌酸激酶系统工作2小时后，游离磷酸盐积累使pH上漂到8.5以上；翻译在pH 8.0以上效率极低。这种情况下延长反应时间不会增加可溶蛋白量，反而在碱性条件下加速蛋白聚集。高浓度的分子拥挤剂进一步放大这一效应——蛋白有效浓度升高确实压缩了折叠空间，但没有足够能量供给来驱动折叠过程，最终变成死角。
解决步骤：
1. 检查能量再生系统：如果用的是磷酸肌酸系统，补充终浓度20 mM而不是常规的10 mM，同时把反应pH回调到7.4。
2. 换用磷酸烯醇式丙酮酸PEP系统（终浓度30 mM），或直接用商品化含高能磷酸键的能量再生混合液，每2小时补加一次母液，不是每管都补，而是统一补到体系中并混匀。
3. 提高缓冲液浓度到100 mM HEPES-KOH pH 7.4，提高体系的pH缓冲能力。分子拥挤剂建议在这步再添加。
验证方法： 反应结束后测pH，正常应维持在7.2–7.6之间。如果pH超过8.0，基本判断为能量副产物累积。每隔1小时取5 µL测定荧光强度或放射性掺入，判断是否还在线性增长期。
第三步：进阶疑难问题
如果你走完上述流程，沉淀问题仍未解决，看看下面几个进阶状况：
1. 分子拥挤剂与膜蛋白/脂质修饰蛋白不相容
经典可溶性蛋白的折叠规律，对膜蛋白完全不适用。如果你的目的蛋白是含跨膜区的膜蛋白或脂修饰蛋白，即使增加拥挤剂浓度，蛋白也不会主动折叠——它需要脂质双层环境提供疏水锚定位点。这类情况要添加脂质体或去垢剂微团，常用的有0.1% DDM或0.5% Brij-35，不推荐用Triton X-100做这类用途，它会造成荧光背景且可能与部分提取物成分产生沉淀。分子拥挤剂在这类体系中的角色非常边缘，主要用来维持已去垢剂增溶的蛋白在溶液中的稳定性，在纯化阶段再加入PEG 4000 5%或蔗糖0.5 M取代它作为稳定剂。
2. 蛋白表达后迅速被蛋白酶切割形成不均一条带
有时沉淀其实是降解产物的非特异聚集体。用E. coli lysate表达某些富含精氨酸或赖氨酸的蛋白时，内源性OmpT蛋白酶和Lon蛋白酶在分子拥挤剂作用下反而更有效地接触到底物。4°C加蛋白酶抑制剂cocktail（不含EDTA的版本，因为Mg²⁺是体系必需）能明显改善可溶性蛋白比例，具体以反应体积的0.1%的体积比添加。同时用BL21(DE3)衍生株的提取物，这类菌株本身OmpT缺陷，比常规Rosetta体系更稳定。
3. 翻译后修饰需求蛋白在当前体系中无法叠成功能构象
磷酸化、糖基化、乙酰化这些修饰在E. coli无细胞体系中大部分不会发生。你的蛋白从序列上看含有多个潜在N-糖基化位点且利用这些位点稳定疏水核心，那沉淀可能是修饰缺失导致的错误折叠。此时要么补充真核提取物体系（兔网织红细胞裂解液），要么在密码子优化层面把糖基化位点附近的氨基酸替换成不影响功能的亲水残基，让蛋白在缺乏修饰时也能折叠。加分子拥挤剂从这个角度看只是表面行为，治标不治本。
避坑总结+实操建议
1. 拥挤剂不是越加越好；5% PEG 4000是多数蛋白在E. coli lysate体系中的起效区间，高于8%要看事故而非看产量。
2. 先解决可溶性问题再谈产量；可溶蛋白少时升级模板浓度只会让沉淀更严重，先从Mg²⁺浓度和能量副产物入手优化基础体系。
3. 每种蛋白都有适合自己所处状态的复合拥挤条件；PEG 4000+Ficoll 400双层拥挤策略不等于叠加功能，合适组合要通过实验矩阵测试才能确定。
日常实验的两个好习惯：新蛋白第一次做无细胞表达时，先跑一块12% Bis-Tris胶看总蛋白分布模式；每次反应后取出10 µL留样放4°C隔夜再离心，看是否有延迟沉淀——这样可以区分共翻译聚集和储存条件下的蛋白不稳定。
如果蛋白真的一直沉淀，排查初期就顺手检查一下基因本身的密码子适应指数和mRNA二级结构强度。无细胞体系里转录和翻译是耦联的，mRNA 5'端二级结构过强会让核糖体加载不足，翻译中途掉落的肽段也是沉淀的重要来源。在平台做一次密码子优化和5'端序列调整，之后同样条件下，上清中可溶蛋白的比例经常能直接翻倍——这和拥挤剂搭配使用效果互补，别把拥挤剂当万能钥匙。