来源：CRISPR割胶纯化脱靶污染排除（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
电泳图上目标条带亮得晃眼，割胶回收后测序却叠峰乱跳、脱靶位点成片出现。你大概率把不该切的胶块切下来了，或者纯化流程里混入了非特异产物。别急着换引物重做，先按下面几步排查，大多数污染在30分钟内能定位。
第一步：快速排查低级错误
1. 紫外灯照射超时：254nm UV照胶超过30秒，DNA会形成环丁烷嘧啶二聚体，导致后续酶切连接效率暴跌。解决——切胶必须关掉看胶仪白光源，改用365nm长波UV，并把单次照胶时间卡在20秒内，宁可暗一点别贪亮。
2. 刀尖碰到邻孔样品：新手最常犯。切完一个条带不换刀片直接切下一个，marker里的DNA片段会随刀尖带进你的胶块。解决——每切一刀换一片无菌手术刀片，或用75%乙醇擦刀片待干后再用。
3. 洗脱缓冲液冷着直接加：4°C放置超过一周的EB buffer直接加到胶块上，硅胶膜释放DNA效率下降40%。解决——把EB buffer分装小管，用前放在55°C金属浴预热5分钟。
4. 凝胶回收柱没活化：有些柱子膜需要先加平衡液。你跳过这步，小片段（<300bp）回收率只剩两成。解决——严格按说明书加平衡液，过柱前室温静置2分钟再离心。
上面的低级错误都排除了？好，往下看系统排查。
第二步：按流程分模块系统排查
模块一：电泳上样前——模板状态决定脱靶底色
原因1：PCR模板含有引物二聚体或非特异性扩增产物
现象：目的条带下方紧邻一条弥散淡带。你把它当成“非特异”忽略，但割胶时刀尖往往顺手把这条淡带一起切走。
原理：引物二聚体长度一般在80-120bp，若gRNA转录模板的目的片段在300bp左右，条带间距不够，切胶时容易连带。更麻烦的是，这些二聚体带有相似的末端序列，后续文库扩增时会和真正的gRNA竞争引物。
解决步骤：
1. 取2μL PCR产物，用1.5%琼脂糖凝胶，120V恒压跑30分钟，确认条带分离效果。
2. 如果二聚体带与目的带间距小于5mm，调整退火温度梯度：58°C、60°C、62°C各跑一管，选择非特异带最浅的那个温度。
3. 回收PCR产物时，用切胶纯化替代直接柱纯化——是的，二次切胶纯化虽然损失20%产率，但能砍掉多数二聚体。用QIAquick凝胶回收试剂盒，溶胶温度严格控制在50°C，超过55°C会让短片段变性。
验证方法：纯化后的模板取1μL跑2%琼脂糖凝胶，100V跑25分钟，紫外灯下应只见到单一条带，无弥散。也可以用Agilent 2100生物分析仪看峰形，单峰且无拖尾即达标。
原因2：质粒模板没有完全线性化，超螺旋构型造成泳动位移
现象：切下“最亮的带”跑出来却是超螺旋环状质粒，而真正的线性DNA模板在更靠上的位置，也就是更大的分子量区域。
原理：同一个DNA分子，超螺旋泳动速度快过线性构型，但电泳迁移率还受琼脂糖浓度影响。在0.8%的胶上，超螺旋的表现分子量可能比实际小40%。若你用的是SpCas9表达质粒做体外转录模板，没线性化或线性化不完全，转录出的RNA在后续切割实验里会产生不可预期的脱靶噪声。
解决步骤：
1. 用限制性内切酶线性化，酶切体系20μL：1μg质粒，10U酶，37°C孵育2小时，不要少于这个时间。
2. 酶切产物中加0.5μL 10% SDS和1μL 20mg/mL蛋白酶K，55°C处理10分钟降解酶蛋白，然后65°C热灭活5分钟。
3. 取3μL酶切产物跑0.8%琼脂糖凝胶，看是否有一条整齐的线性带，亮度应占全部DNA的90%以上。若出现双带，补加1μL酶再37°C消化1小时。
验证方法：取1μL线性化产物进行琼脂糖凝胶电泳，对照未酶切质粒观察迁移差异。酶切完全的产物条带单一、迁移位置较超螺旋明显滞后。
模块二：电泳与割胶环节——脱靶污染进入胶块的高危区
原因3：目的条带和脱靶片段共迁移，肉眼无法分辨
现象：割胶回收后的DNA测序信号正常，但脱靶位点检测富集比例异常高。跑1.5%凝胶时，目标是280bp，脱靶的≈270bp，看似分开了，实际共迁移了。
原理：标准琼脂糖凝胶对差20bp以内的DNA片段分辨力很低。CRISPR脱靶片段往往伴随单碱基或小片段插入缺失（indel），长度变化幅度15bp左右，这正好落在琼脂糖的“盲区”。
解决步骤：
1. 对目的片段小于400bp的gRNA模板，弃用琼脂糖凝胶，改用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），胶厚1.0mm，1×TBE缓冲液，120V恒压跑90分钟。
2. 用SYBR Gold染色替代EB，灵敏度高出25倍，能在蓝光下观察到更细微的分带。染色后必须用纯水漂洗凝胶3次、每次5分钟，否则SYBR Gold会抑制后续PCR。
3. 切胶前在凝胶旁放一把DNA ladder尺，用直尺量取目标条带与梯带的距离，宁可切窄0.5mm也要丢弃边缘模糊部分。
验证方法：切胶回收后，取回收液2μL跑相同的PAGE体系，银染或SYBR Gold复染，只应看到单一目标条带。不确定的话，做一次qPCR，用脱靶位点特异性引物扩增，Ct值比目标位点高7个循环以上才算干净。
原因4：割胶操作本身带入邻近脱靶条带
现象：你切下来的胶块体积有80μL，但目的条带的实际胶体积只有30μL。多切的部分，就是脱靶污染的物理载体。
原理：琼脂糖凝胶切块时，手术刀从凝胶表面垂直扎入会产生一个“挤压效应”，胶块边缘5mm内的DNA会被挤出孔隙并随刀片附着。切得越宽，污染面积越大。
解决步骤：
1. 把DNA跑进胶后，先在白光板上观察凝胶厚度。用手术刀在目的条带上方1mm处划一道浅痕，下方1mm处再划一道，切断后轻轻挑出中间部分。
2. 切下的胶条立刻放在已知质量的1.5mL离心管中称重。如果胶块质量超过200mg，说明切大了——重新跑胶再做一次，别心疼样品。
3. 每切一个样品用新刀片，不同样品间隔不要用同一把镊子碰触凝胶。镊子尖用0.5M HCl浸泡5分钟再蒸馏水冲洗，消除DNA残留。
验证方法：切完胶后把“废胶”重新放回电泳槽，加新鲜缓冲液再跑15分钟，看是否有残留条带。没条带说明切干净了；有条带说明你刚才切漏了，目标条带部分留在了废胶里。
模块三：洗脱纯化——末端操作同样能引入问题
**原因5：洗脱体积不足导致目标DNA未完全回收，隐性脱靶被富