来源：mRNA转染免疫原性核苷修饰比例（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
你辛辛苦苦体外转录完mRNA，转染到细胞里，6小时后细胞开始飘，24小时后死一半，GFP却没亮几个。大概率是免疫原性没控制住，罪魁祸首常常是核苷修饰比例没做好。这篇教程从新手容易踩的低级错误讲起，一路挖到dsRNA污染、内毒素残余和细胞系差异，帮你按步骤定位问题。
第一步：快速排查低级错误
1. 用了100%尿苷（U）做转录？——裸mRNA进胞质就是RIG-I的靶子，直接改用N1-甲基假尿苷全替换，别留原装U。
2. 转染试剂和mRNA比例失衡？——Lipofectamine MessengerMAX按1 μg mRNA加1.5 μL试剂，照说明书走，别自己加倍。
3. 细胞密度不对？——六孔板转染当天密度要70%-80%。太稀的细胞对干扰素信号更敏感，死得更快。
4. 传代次数太高？——超过20代的HeLa对dsRNA刺激变迟钝，原代细胞却格外敏感。换低代次，先加一孔野生型对照。
第二步：分维度系统排查
1. 核苷修饰比例本身：全替换还是半吊子？
现象：转染后24小时，细胞存活率只剩50%，报告基因表达也不高。你用的是“50% N1-甲基假尿苷