来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
# 蛋白质工程：开启天然产物生物合成与合成生物学新纪元的设计之门
导语
天然产物及其衍生物一直是创新药物与高值化学品的重要源泉，但其复杂结构常使化学全合成步履维艰，而天然宿主的低产与难培养特性又大大限制了其开发。近年来，合成生物学的蓬勃发展为天然产物的异源重构与结构创新提供了全新路线，而处于这一范式核心的正是蛋白质工程。北卡罗来纳州立大学Gavin J. Williams团队在《Protein Engineering, Design and Selection》发表的综述系统阐述了如何将定向进化、理性设计与计算工具相结合，对聚酮合酶、非核糖体肽合成酶、糖基转移酶等一系列巨型合成酶进行精准重塑，从而突破天然催化藩篱，加速新分子创造。文章不仅全景式展示了领域关键突破，更为“以酶为笔，描绘分子世界”的未来蓝图勾勒出清晰路径。
研究背景
长久以来，天然产物凭借无与伦比的化学多样性和生物活性，在抗生素、抗癌、免疫抑制等领域占据不可撼动的地位。然而，传统获取方式严重依赖天然资源提取或半合成衍生，面临周期长、收率低、结构修饰空间狭窄等瓶颈。随着基因组测序技术与生物信息学的飞速发展，大量隐秘的次级代谢生物合成基因簇被挖掘，为合成生物学途径重构奠定了物质基础。
将整个生物合成途径搬进大肠杆菌、酿酒酵母或链霉菌等异源底盘中，虽可解决来源问题，但往往因异源酶的活性低下、底物谱不匹配、区域选择性与立体选择性不足而无法实现高效生产。更令人向往的“非天然”天然产物——即骨架或修饰程度超越已知化学空间的新分子——则要求生物催化元件具备超越自然进化的催化能力。于是，对途径中的关键酶进行工程化改造，成为合成生物学深度介入天然产物创新的核心引擎。
正如该综述所指出的，天然产物生物合成装置中充斥着多结构域巨型酶和高度底物特异性的修饰酶，如I型聚酮合酶（PKS）、非核糖体肽合成酶（NRPS）、萜环化酶、糖基转移酶、细胞色素P450氧化酶等。这些酶天然的模块化组织形式为蛋白质工程提供了绝佳的操作框架，但巨大分子量、构象动态性、缺乏高分辨结构信息等挑战又使改造工作如履薄冰。作者系统梳理了过去近十年来，如何将经典蛋白质工程理念与新兴计算预测、高通量筛选技术融合，逐步驯服这些制造天然产物的“分子工厂”。
研究方法
本文并非呈现单一实验研究，而是从工程方法论角度深度解析了改造天然产物生物合成酶的多元技术路线。作者将该领域所倚仗的蛋白质工程策略清晰地划分为三大支柱：定向进化、理性与半理性设计、以及数据驱动的计算方法，并进一步说明了如何在各类合成酶体系中将它们融会贯通。
**定向进化随机诱变与高通量筛选**仍是当之无愧的基石。通过易错PCR、DNA shuffling或体内连续进化等手段对目标酶基因进行随机突变，再结合快速、灵敏的高通量筛选体系（如比色法、荧光底物、基于生物传感器的遗传筛选等）将稀有的功能增益突变体从庞大文库中“钓取”出来。该策略不依赖结构信息，能够发现远程或协同突变带来的涌现性质。文章重点例举了P450单加氧酶和卤化酶的定向进化，展示了如何将偏好简单底物的酶重塑为能够加工复杂天然产物骨架的高效催化剂，同时实现区域和对映选择性的精准控制。
**基於结构的理性与半理性设计**则充分利用日益积增的晶体结构和同源模型，将工程焦点收敛至少量关键残基。作者特别强调了“活性位点重塑”策略：通过分析活性位点空腔的电荷分布、空间位阻和底物结合构象，对第一配位层和第二配位层残基进行饱和突变或组合突变，以重构氢键网络或扩大底物通道。对模块化PKS和NRPS而言，结构域界面工程成为一种高阶理性设计。例如，通过调谐酰基转移酶（AT）结构域的底物结合口袋残基，可以改变其对不同酰基辅酶A延伸单元的选择性，从而在聚酮链中引入非天然砌块。又如，对NRPS的腺苷酰化（A）结构域进行编码重编程，能够通读非蛋白源氨基酸，为脂肽类化合物拓展无限的多样性空间。
**计算建模与数据驱动设计**正成为该领域加速提效的新引擎。文章系统讨论了从分子动力学模拟、量子力学/分子力学（QM/MM）计算，到基于机器学习的蛋白质功能预测平台如何改变传统“试错”式工程范式。Rosetta、AlphaFold2等工具使得高精度结构预测与全新酶设计成为可能，能够对缺乏实验结构的巨型PKS模块进行域间排列和底物隧道的理性重塑。更引人注目的是，作者阐明了一种“设计-构建-测试-学习”的闭环策略：将有限的实验数据喂给机器学习模型，预测适合的组合突变体，再经一轮合成生物学装配和测试反馈，使进化路径在更短轮次内收敛至全局最优解。这一部分为合成生物学语境下的按需酶元件开发提供了可复制的技术蓝图。
研究结果
文章凝炼了蛋白质工程在多类天然产物合成酶系统中取得的标志性成果，用大量核心数据与案例展示了“改造能力”与“创新空间”的同步跃迁。
**聚酮合酶与非核糖体肽合成酶**作为最庞大的模块化组装线，其工程成果尤为耀眼。团队详述了通过AT结构域交换或定点突变，将原本只接受丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A的PKS转变为能够引入丙炔基、叠氮基、卤代烷基等生物正交柄的非天然延伸单元，催化效率可保持野生型的60%以上。更为激进的全模块替换与缩减，甚至实现了骨架碳链长度的重编程，让六模块大黄素生物合成装置衍生出一系列非经典链长的芳香聚酮。NRPS方面，A结构域特异性密码子突变被系统总结，特定残基突变可使底物谱从亮氨酸转向苯丙氨酸，催化效率(kcat/Km)提升数十倍。结合缩合（C）结构域的定向进化，多个非核糖体肽产物达到克级每升的产率，突破了天然痕量产出的极限。
**糖基转移酶与氧化酶**则淋漓尽致地体现了“选择性工程”的威力。糖基化修饰深刻影响天然产物的溶解性、靶向性和生物活性。综述列举了来源于植物和微生物的糖基转移酶如何通过活性位点少数突变，实现对黄酮、萜类、大环内酯等不同苷元骨架的宽泛底物接纳，并能够交替使用多种NTP-糖供体，甚至以非天然糖供体合成“人工糖苷”。例如，OleD糖基转移酶变体可催化形成包含叠氮葡萄糖、荧光糖等多样糖缀合物，区域选择性可达>95%。细胞色素P450作为氧化功能化的中坚，通过进化工程将大肠杆菌中表达的P450 BM3从脂肪酸羟化酶重塑为能够立体选择性氧化青蒿素前体紫穗槐二烯、孕激素及多种萜类核心骨架的万能氧化工具，某些位置的选择性氧化转化数超过5000，且无需额外氧化还原伙伴的复杂优化。
**其他修饰酶与全途径协同工程**同样收获颇丰。卤化酶工程创造了定点氯代和溴代的色氨酸衍生物，为后期功能化博罗了化学手柄；甲基转移酶的理性改造实现了对儿茶酚类天然产物的精准单甲基化与双甲基化控制。更值得关注的是，综述强调将多个工程化酶元件重新拼装成全途径后涌现出的协同效应——通过匹配各酶变体的动力学参数与代谢通量，解除瓶颈步骤反馈抑制，异源途径的总产率较初始设计提高了1-2个数量级。这一从“单酶精修”到“途径协调”的跨越，赋予合成生物学更接近“真实代谢”的工程思维。
讨论与展望
作者在总结中指出，蛋白质工程已从初始的对单个酶性质的修补，跃迁为对生物合成途径中多酶体系进行系统设计与全局优化的新阶段。然而，巨型合成酶的结构动态性、结构域间通信的精细密码，以及多位点协同突变带来的组合爆炸，仍是限制工程深度和广度的核心挑战。
展望未来，机器学习和深度生成模型将可能彻底改变酶的改造范式。利用大规模功能获得/丢失数据进行预训练，模型有潜力在虚拟空间中预测能容纳特定非天然底物的活性位点氨基酸组合，从而将大规模筛选转为小型聚焦文库的构建。此外，冷冻电镜与整合结构生物学的发展，将越来越多地呈现PKS和NRPS在不同催化状态下的全息结构，使精准理性设计成为常态。合成生物学与蛋白质工程的深度融合将进一步催生“设计-构建-测试-学习”的自动化工作站，将DNA合成、无细胞表达、微流控筛选与计算迭代融为一体，最终实现从基因序列到目标天然产物的端到端按需制造。
诚如文中所言，蛋白质工程已不仅是揭示酶催化机理的工具，更是开辟非天然天然产物化学空间的战略利器。当工程化合成酶与代谢途径重构、遗传密码拓展、生物正交化学交叉融合之际，人类将以前所未有的自由度“重写”分子演化史，为医药、农业、材料科学供给源源不断的新结构、新功能与新希望。
参考来源
Calzini M A, Malico A A, Mitchler M M, et al. Protein engineering for natural product biosynthesis and synthetic biology applications[J]. *Protein Engineering, Design and Selection*, 2021, 34: gzab015. DOI: 10.1093/protein/gzab015
DOI: 10.1093/protein/gzab015