来源：DNA连接效率低载体去磷酸化处理（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做克隆最烦什么？连接转化长不出克隆。载体去磷酸化做了，背景还是高；或者连接效率低到怀疑人生。别急着换试剂，大概率是某个细节没到位。这篇教程从低级错误到进阶疑难，帮你把去磷酸化相关的连接问题一次性排查干净。
第一步：快速排查低级错误
1. 酶失活。去磷酸化酶（CIP、SAP或rSAP）用前没冰浴，或者室温放太久。解决：分装保存，用一支融一支，融后立即放冰上，用完放回-20°C。
2. buffer用错。CIP、SAP、rSAP有各自的buffer，拿限制酶buffer直接配去磷酸化反应，pH不对，酶直接废。解决：看说明书用配套的10× buffer，注意是否需要钙镁离子。
3. 载体量算错。反应体系里载体DNA太少（低于0.2 pmol），酶再猛也难反应。解决：1 μg线性化载体用1 U rSAP，37°C孵育30分钟。片段长度不同，pmol换算用在线计算器。
4. 没加热灭活。连接前没把去磷酸化酶灭活，酶会继续去掉连接产物上的5'磷酸。解决：CIP用80°C加热15分钟；SAP和rSAP用65°C加热5分钟。
第二步：分维度系统排查
按流程顺序来，每步验证完再进下一步。
1. 载体线性化完整度
现象：酶切后跑胶看到一条带，但实际没切透，有少量超螺旋质粒残留。
原理：去磷酸化只作用于DNA末端的5'磷酸。如果载体还有未切开的超螺旋，转化时超螺旋质粒直接进入细胞，产生背景菌落。你看见菌落多，就以为连接效率低。
怎么判断：酶切产物跑胶，如果除了线性带，上方或下方还有暗带，就是没切完。如果只有一条带，也未必干净，超螺旋量少时可能看不见。
怎么验证：取1 μL酶切产物直接转化感受态，涂板。如果长出超过10个菌落，说明有质粒残留。
怎么解决：酶切时1 μg DNA用10 U酶，37°C孵育1小时。如果难切的位点，补加0.5 μL酶再孵育30分钟。然后切胶回收线性条带，不要直接沉淀酶切反应液。
2. 去磷酸化反应条件
现象：去磷酸化后，自连对照（只加载体不加插入片段）还是长很多菌，和没处理的差不多。
原理：酶量不够，或者时间太短。你按